Śledzenie transportu aksonalnego organelli w neuronach ruchowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Zacznij od komory mikroprzepływowej pokrytej polimerem z dołamkami proksymalnymi i dystalnymi połączonymi wieloma mikrorowkami.

W studzience proksymalnej umieść embrionalne tkanki rdzenia kręgowego myszy bogate w rozwijające się neurony ruchowe.

Uzupełnij to dobrze pożywką. Inkubuj, aby umożliwić wzrost neuronów i przyleganie do powierzchni pokrytej polimerem.

Później dodaj pożywkę bez czynnika wzrostu do studzienki proksymalnej

.

W studzienkach dystalnych dodaj większą objętość pożywki zawierającej czynniki wzrostu, aby uzyskać różnice w stężeniu i objętości.

Różnice te powodują, że aksony, dłuższe projekcje neuronalne, rosną w kierunku dystalnych studzienek przez mikrorowki.

Dodaj fluorescencyjny roztwór barwnika do obu studzienek.

Cząsteczki barwnika dostają się do neuronów i barwią mitochondria i kwaśne organelle na obu końcach.

W obrazowaniu konfokalnym na żywo fluorescencyjnie barwione organelle poruszają się w obu kierunkach między ciałami komórek nerwowych a aksonami, potwierdzając transport aksonalny w neuronach ruchowych.

Usunąć całe podłoże z proksymalnej komory MFC. Podnieś pojedynczy eksplant rdzenia kręgowego za pomocą pipety o łącznej objętości czterech mikrolitrów i wstrzyknij go jak najbliżej jaskini. Wyciągnij nadmiar płynu z dołu proksymalnego przez boczne wyloty. Powtórz poprzedni krok jeszcze dwa razy i upewnij się, że eksplantaty są osadzone w kanale proksymalnym. Powoli dodaj 150 mikrolitrów pożywki SCEX do studzienki proksymalnej.

Jednego dnia po posiewie wymień pożywkę SCEX w komorze proksymalnej i dodaj bogatą pożywkę SCEX do komory dystalnej, utrzymując gradient objętości co najmniej 15 mikrolitrów na studzienkę między studzienką dystalną i proksymalną. Po czterech do sześciu dniach aksony powinny przejść do dystalnego przedziału i być gotowe do obrazowania transportu aksonalnego.

Aby oznaczyć mitochondria i przedziały kwasowe, przygotuj świeżą pożywkę SCEX ze 100-nanomolowym Mitotracker deep red FM i 100-nanomolowym czerwonym LysoTracker i dodaj go do komór mikroprzepływowych. Inkubuj je przez 30 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umyj trzykrotnie ciepłym podłożem SCEX. Kontynuuj obrazowanie na żywo transportu aksonalnego, uzyskując 100-poklatkową serię zdjęć w odstępach 3-sekundowych, w sumie 5 minut na film.