JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:51 min • July 8th, 2025
Weźmy szczura, który został poddany eutanazji.
Otwórz brzuch, wytnij pęcherz i zanurz go w buforze.
Rozetnij pęcherz moczowy i usuń przylegający tłuszcz i resztki tkanek.
Przenieś pęcherz do probówki zawierającej bufor, odwiruj i usuń zanieczyszczenia.
Umieść tkankę w roztworze zawierającym kolagenazę i zmiel ją. Dodaj więcej kolagenazy, aby zdegradować macierz zewnątrzkomórkową, rozluźniając komórki.
Odwirować i wyrzucić supernatant. Dodaj trypsynę, aby zakłócić połączenia komórka-komórka, uwalniając komórki.
Dodać pożywkę płuczącą zawierającą białka, aby dezaktywować trypsynę, następnie odwirować i usunąć supernatant.
Ponownie zawiesić komórki w pożywce, przefiltrować je w celu usunięcia agregatów i uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
Odwirować i usunąć supernatant. Ponownie zawieś komórki w pożywce.
Umieść komórki na powlekanych szkiełkach nakrywkowych, aby ułatwić przyczepianie się komórek neuronalnych i glejowych. Usuń nieprzyłączone komórki.
Dodaj pożywki neuronalne zawierające czynniki wzrostu, aby promować dojrzewanie komórkowe, ustanawiając pierwotną kulturę neuronalną i glejową.
Zacznij od umieszczenia szczurów na wysterylizowanym ręczniku chirurgicznym i odsłonięcia brzucha. Użyj nożyczek i kleszczy, aby otworzyć jamę brzuszną i odsłonić pęcherz. Użyj innego zestawu nożyczek i kleszczy, aby delikatnie podnieść pęcherz i odciąć go od szyjki pęcherza.
Następnie szybko umieść pęcherz w zimnym, stabilnym tlenie roztworze Krebsa, aby poprawić przeżycie komórek. Dodać roztwór Krebsa do trzech szklanych naczyń i trzech szklanych zlewek i umieścić je w łaźni lodowej w celu wstępnego schłodzenia. Ponumeruj naczynia i zlewki 1, 2 i 3, aby uniknąć pomyłek.
W szklanym naczyniu 1 otwórz pęcherz za pomocą nożyczek okulistycznych i rozłóż go za pomocą kleszczy i rozdzielacza jądra łyżkowego. Opłucz pęcherz w szklanej zlewce 1 i umieść go w szklanym naczyniu 2. Wyeliminuj przylegający tłuszcz na powierzchni tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek okulistycznych. Następnie opłucz pęcherz w zlewce 2 i umieść go w naczyniu 3.
Delikatnie zeskrob pęcherz za pomocą kleszczy i rozdzielacza jądra łyżki, aby usunąć egzogenne przyczepy. Wypłucz pęcherz w szklanej zlewce 3 i przenieś go do 15-mililitrowej probówki wirówkowej z 14 mililitrami zimnego roztworu Krebsa. Odwirowywać próbkę przez 1 minutę w temperaturze 360 razy g i 4 stopnie Celsjusza.
Przenieść pęcherz z probówki wirówkowej do 2-mililitrowej fiolki zawierającej 1 mililitr roztworu wytrawiającego. Użyj nożyczek okulistycznych, aby pociąć pęcherz na małe kawałki. Wymieszaj roztwór do pęcherza moczowego z 9 mililitrami roztworu trawiącego 1 w sterylnym naczyniu do hodowli komórkowych. Pierwsze wytrawianie należy przeprowadzić w inkubatorze z wytrząsaniem przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przy 200 obr./min. Po pierwszym roztrawieniu odwirować roztwór w temperaturze 300 razy g i 4 stopnie Celsjusza przez 8 minut.
W międzyczasie umieść roztwór trawiący 2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu podgrzania. Po odwirowaniu usuń większość supernatantu zawierającego roztwór trawiący 1, pozostawiając trochę supernatantu, aby uniknąć utraty komórek.
Ponownie zawieś komórki w ciepłym roztworze do wytrawiania 2 i potrząśnij mieszaniną podczas trawienia w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut. Po zakończeniu trawienia natychmiast dezaktywuj trypsynę, dodając 10 mililitrów zimnego środka do płukania. Odwiruj komórki w temperaturze 360 g i 4 stopni Celsjusza przez 8 minut. Następnie usuń jak najwięcej supernatantu, aby wyeliminować całą trypsynę.
Delikatnie ponownie zasmuś osad za pomocą 3 mililitrów pożywki neuronowej, uważając, aby nie generować pęcherzyków powietrza w roztworze. Przefiltruj zawiesinę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Zbieraj komórki przez odwirowanie w temperaturze 360 razy g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 8 minut. Następnie delikatnie ponownie zawieś granulki komórkowe w 1 mililitrze pożywki neuronowej A i dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 48-dołkowej płytki. Hodowla komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.