Stymulowanie różnicowania komórek neuronalnych za pomocą złotych nanoprętów

Zacznij od komórek nerwowych hodowanych w pożywce różnicowania komórek.

Dodaj złote nanopręty do podłoża.

Inkubuj, aby komórka mogła pochłonąć nanopręt w procesie zwanym endocytozą.

Stymuluj nanopręty za pomocą lasera.

Wiązka laserowa wzbudza elektrony powierzchniowe na nanopręcie. Wzbudzone elektrony wracają następnie do stanu podstawowego, uwalniając energię cieplną.

Ciepło to stymuluje komórki nerwowe do wytwarzania wypustek wspieranych przez specyficzne białko cytoszkieletu zwane βIII-tubuliną.

Usuń zużyte medium.

Napraw komórki. Dodaj odpowiedni detergent, aby przepuszczalność membrany.

Dodaj środek blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Oznacz komórki pierwszorzędowymi przeciwciałami, które są skierowane przeciwko βIII-tubulinie.

Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe, które oddziałują z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Zabarwić jądro niebieskim barwnikiem fluorescencyjnym.

Za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej obserwuj czerwone komórki z niebieskimi jądrami.

Wydłużone wypustki komórki wskazują na różnicowanie komórek nerwowych.

Hoduj komórki neuronalne NG108-15 w 10 mililitrach pożywki do hodowli komórkowej w kolbie T75, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze. Gdy komórki zlewają się w 70% do 80%, zmień pożywkę na ciepłą, świeżą.

Następnie mechanicznie odłącz komórki, delikatnie uderzając w dno kolby konfluentnej. Odwirować zawiesinę komórkową przez pięć minut przy 600 g i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 mililitrach ciepłej pożywki do różnicowania komórek. Następnie zasiej komórki na 96-dołkowej płytce z 200 mikrolitrami pożywki różnicującej komórki.

Inkubować próbkę przez jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj roztwór złotego nanopręta i inkubuj go przez dodatkowe 24 godziny. W tej procedurze sprzęgnij laser ze światłowodem jednomodowym i zakończ go złączem FC. Zmierz moc wyjściową lasera za pomocą standardowego miernika mocy.

W 3 dniu inkubacji nanoprętów przymocuj złącze FC do studzienki, napromieniuj próbkę i kontrolę w temperaturze pokojowej przez 1 minutę w ciągłej fali o różnych mocach lasera. W dniu 5 usuń pożywkę do różnicowania komórek z próbki i utrwal ją roztworem formaldehydu o stężeniu 3,7% objętości na objętość na 10 minut.

Następnie przepuszczaj komórki z 0,1% objętości na objętość Triton X-100 przez 20 minut. Następnie dodaj 3% masy na objętość BSA do próbki przez 60 minut, aby zablokować nieprzereagowane miejsca wiązania białek. Oznaczyć próbkę anty-beta-3-tubuliną przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnego dnia inkubuj komórki przez 90 minut w ciemności, z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym. Następnie oznacz jądra komórkowe DAPI przez 10 minut, a następnie zobrazuj próbkę za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej, używając obiektywu co najmniej 20x. Wybierz filtry mikroskopu zgodnie z przeciwciałem wtórnym i wybierz filtr DAPI, aby uwidocznić jądra komórkowe.