JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:10 min • July 8th, 2025
Zacznij od zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju w pożywkach zarodkowych.
Usunąć kosmówkę, błonę ochronną otaczającą zarodki, i przenieść zarodki na świeżą płytkę hodowlaną zawierającą pożywkę.
Usuń część ogonową zarodka, a następnie oddziel głowę i delikatnie oderwij oczy od głowy.
Oczy zawierają siatkówkę, cienką warstwę tkanki, w której znajdują się komórki zwojowe siatkówki.
Przenieś oczy do probówki zawierającej pożywkę do hodowli komórek danio pręgowanego.
Mechanicznie rozdziel oczy, aby uwolnić komórki zwojowe siatkówki i utworzyć zawiesinę jednokomórkową.
Pobrać szkiełka nakrywkowe umieszczone na płytce hodowlanej zawierającej pożywkę hodowlaną danio pręgowanego.
Szkiełka nakrywkowe są pokryte syntetycznym polimerem i białkiem adhezyjnym.
Przenieś komórki na środek szkiełka nakrywkowego i inkubuj.
Komórki zwojowe siatkówki przyczepiają się do pokrytych powierzchni, a ponadto komórki te rozwijają długie wypustki zwane aksonami.
Wyjmij zarodki danio pręgowanego z inkubatora i zanurz je w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 70% etanolu na 5 do 10 sekund, aby je wysterylizować. Za pomocą pipety transferowej przenieś zarodki do naczynia E2 Media #1 zawierającego sterylne podłoże E2, aby zmyć nadmiar etanolu. Następnie przenieś zarodki do szalki E2 Media #2 i usuń ich kosmówkę ostrymi kleszczami. Na koniec przenieś zarodki do szalki E2 Media #3 w celu przeprowadzenia sekcji.
Za pomocą cienkich kleszczy ustaw i przytrzymaj zarodki przed żółtkiem za pomocą jednego z kleszczy, a drugim kleszczami usuń ogon z tyłu woreczka żółtkowego. Chwyć szyję kleszczami i zdejmij głowę, aby wystawić mózg i oczy na działanie pożywki E2. Czubkiem cienkich kleszczy delikatnie przewróć oczy od głowy, jednocześnie przytrzymując tkankę czaszki w dół drugimi kleszczami. Przenieść cztery oczka do jednej z wcześniej przygotowanych probówek zawierających ZFCM+.
Delikatnie rozcieraj pipetą P20 w górę i w dół około 45 razy, aby rozdzielić komórki. Przenieś ZFCM+ ze zdysocjowanymi komórkami do środka szkiełek nakrywkowych. Utrzymuj kultury na stole w temperaturze 22 stopni Celsjusza, na stojaku z pianki polistyrenowej, aby pochłaniać wibracje. W dniu obrazowania sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić wzrost aksonów RGC.