JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:06 min. • July 8th, 2025
Zacznij od dodania komórek nerwowych do odpowiedniego podłoża w naczyniu hodowlanym.
Dodaj fluorescencyjne nanocząstki magnetyczne lub MNP zawierające rdzeń magnetyczny oznaczony barwnikiem fluorescencyjnym.
Podczas inkubacji komórka pobiera MNP poprzez endocytozę i ulega namagnesowaniu.
Umieść czyste, namagnesowane, wzorzyste podłoże w naczyniu hodowlanym. To szklane podłoże ma osadzone geometryczne wzory o właściwościach magnetycznych.
Wysterylizuj podłoże, wystawiając je na działanie światła ultrafioletowego.
Pokryj podłoże kolagenem, aby promować przyczepianie komórek.
Dodaj komórki obciążone MNP do substratu i inkubuj.
Zewnętrzne pole magnetyczne podłoża przyciąga komórki obciążone MNP, umożliwiając ich przyłączenie.
W regularnych odstępach czasu dodawać pożywkę zawierającą określony czynnik wzrostu.
Czynnik wzrostu pomaga komórkom w tworzeniu rozszerzeń, podczas gdy wzór magnetyczny podłoża kieruje orientacją tych rozszerzeń.
Zasiej 1 milion komórek w zwykłym, niepowlekanym 35-milimetrowym naczyniu. Dodać obliczoną objętość zawiesiny MNP i pożywki różnicującej do naczynia, aby uzyskać pożądane stężenie MNP. Wymieszaj komórki, MNP i pożywkę różnicującą, a następnie inkubuj naczynie w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Oczyść wzorzyste podłoże 70% etanolem i umieść je w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym w okapie. Umieść duży magnes pod wzorzystym podłożem na jedną minutę, a następnie usuń go, przesuwając naczynie w górę i odsuwając je oraz wyjmując magnes z okapu. Włącz światło ultrafioletowe na 15 minut.
Aby przygotować szklane podłoże pokryte kolagenem, rozcieńczyć kolagen typu I w stosunku 1 do 50 w 30% etanolu. Przykryj szklankę roztworem. Pozostaw naczynie bez przykrycia w okapie na cztery godziny, aż cały roztwór wyparuje. Następnie umyj go trzy razy w sterylnym PBS. Wyjąć komórki z inkubatora. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 200 g i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 mililitrze świeżej pożywki różnicującej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
Wysiewaj 105 komórek na podłożu w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym i dodaj 2 mililitry pożywki różnicującej. Inkubuj kulturę w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach dodaj do komórek od 1 do 100 świeżych mysich beta-NGF. Odnowić pożywkę różnicującą i dodawać świeży beta-NGF co dwa dni.