JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:50 min. • July 8th, 2025
Weźmy ludzką tkankę mózgową zanurzoną w roztworze do krojenia. Biologiczne pH roztworu i składniki odżywcze pomagają w utrzymaniu funkcjonalności tkanek.
Usuń najbardziej zewnętrzną warstwę opon mózgowych i przytnij tkankę, aby uzyskać płaską powierzchnię.
Zetrzyj nadmiar roztworu z tkanki. Przymocuj przyciętą tkankę do krążka próbki za pomocą bloku agarozy, utrzymując tkankę w kontakcie z blokiem w celu ułatwienia cięcia.
Umieść krążek w tacce buforowej z wibratomem i przykryj tkankę lodowatym roztworem do krojenia.
Za pomocą wibratomu wygeneruj jednolite plasterki, które zachowują architekturę tkanki.
Odetnij nadmiar tkanki, zapewniając stałą proporcję istoty szarej i białej.
Umieścić plastry na płytce wielodołkowej zawierającej pożywkę hodowlaną i inkubować.
Plastry pozostają zawieszone w pożywce, aby zapewnić równomierny dostęp do składników odżywczych, technika znana jako kultura plastrów w swobodnych pływaniach.
Regularnie uzupełniaj kulturę pożywką uzupełnioną neuronalnym czynnikiem wzrostu, aby utrzymać żywotność tkanek.
Przenieść próbkę na szalkę Petriego zawierającą roztwór do krojenia. Za pomocą drobnych narzędzi chirurgicznych ostrożnie usuń jak najwięcej pozostałych opon mózgowych. Wybierz najlepszą orientację próbki do produkcji plastrów o szczególnych cechach projektu eksperymentalnego i użyj ostrza skalpela numer 24, aby przyciąć płaską powierzchnię, która będzie podstawą, która zostanie przyklejona do dysku próbki.
Za pomocą jednorazowej plastikowej łyżki i delikatnych pędzli zbierz fragment z szalki Petriego, a nadmiar roztworu osusz bibułą filtracyjną. Następnie użyj super kleju, aby przymocować tkankę do naczynia z próbką wibratomową, aż mocno przylgnie do naczynia i zetknie się z blokiem agarozy.
Umieść krążek z próbką wibratomu w tacy buforowej wibratomu. Zablokuj uchwyt noża na miejscu, gdy żyletka jest mocno zamocowana. Dodaj roztwór do krojenia i upewnij się, że zakrywa zarówno próbkę, jak i ostrze. Następnie zacznij kroić próbkę na plastry o wielkości 200 mikrometrów.
Przenieść plastry z tacki buforowej na szalkę Petriego zawierającą roztwór do krojenia i przyciąć luźne krawędzie i nadmiar istoty białej do proporcji około 70% kory i 30% istoty białej. W komorze z przepływem laminarnym dodaj 600 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdego dołka 24-dołkowej płytki i inkubuj w temperaturze 36 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej 20 minut przed posianiem plastrów. Następnie użyj pędzla, aby umieścić jeden plasterek w każdym dołku.
Jeśli na płycie znajdują się jakieś niewykorzystane studzienki, napełnij je 400 mikrolitrami sterylnej wody. Inkubować w temperaturze 36 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Uzupełnić 10 mililitrów wcześniej przygotowanej pożywki neurotroficzną czynnikiem neurotroficznym pochodzenia mózgowego w stężeniu 50 nanogramów na mililitr.
Po 8 do 16 godzinach usuń 333 mikrolitry kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki i dodaj 133 mikrolitry świeżej pożywki uzupełnionej BDNF. Co 24 godziny należy zastępować jedną trzecią kondycjonowanej pożywki świeżą pożywką uzupełnioną BDNF.