Izolacja i hodowla mikrogleju z mózgów szczurów przy użyciu pożywek bez surowicy

Weźmy perfundowany mózg szczura. Zmiel go na małe fragmenty.

Homogenizuj tkankę w buforze, aby uwolnić komórki, w tym mikroglej.

Gdy niestrawiona tkanka opadnie, zbierz komórki zawierające supernatant i dodaj bufor do separacji mieliny.

Wymieszaj zawartość i odwiruj, aby oddzielić komórki od mieliny i zanieczyszczeń. Usunąć warstwę mieliny i supernatant.

Ponownie zawieś komórki w buforze i pipecie, aby oddzielić grudki.

Przepuścić zawiesinę przez sitko w celu usunięcia pozostałych agregatów komórkowych.

Przefiltrowane komórki przenieść na płytkę hodowlaną pokrytą przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla mikrogleju. Inkubować w celu ułatwienia adhezji mikrogleju.

Przemyć buforem, aby usunąć nieprzylegające komórki. Dodaj trypsynę i inkubuj, aby rozluźnić mikroglej.

Usuń trypsynę.

Dodaj pożywkę bez serum. Inkubuj na lodzie, aby osłabić interakcje komórka-substrat.

Odpipetować i zebrać zawiesinę do probówki. Odwirować i usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić mikroglej w pożywce niezawierającej surowicy i przenieść na płytkę wielodołkową pokrytą kolagenem. Inkubować w celu ułatwienia adhezji mikrogleju.

Dodaj pożywkę z czynnikami wzrostu i lipidami. Inkubować w celu dojrzewania m