Izolacja i hodowla mikrogleju z mózgów szczurów przy użyciu pożywek bez surowicy

Weźmy perfundowany mózg szczura. Zmiel go na małe fragmenty.

Homogenizuj tkankę w buforze, aby uwolnić komórki, w tym mikroglej.

Gdy niestrawiona tkanka opadnie, zbierz komórki zawierające supernatant i dodaj bufor do separacji mieliny.

Wymieszaj zawartość i odwiruj, aby oddzielić komórki od mieliny i zanieczyszczeń. Usunąć warstwę mieliny i supernatant.

Ponownie zawieś komórki w buforze i pipecie, aby oddzielić grudki.

Przepuścić zawiesinę przez sitko w celu usunięcia pozostałych agregatów komórkowych.

Przefiltrowane komórki przenieść na płytkę hodowlaną pokrytą przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla mikrogleju. Inkubować w celu ułatwienia adhezji mikrogleju.

Przemyć buforem, aby usunąć nieprzylegające komórki. Dodaj trypsynę i inkubuj, aby rozluźnić mikroglej.

Usuń trypsynę.

Dodaj pożywkę bez serum. Inkubuj na lodzie, aby osłabić interakcje komórka-substrat.

Odpipetować i zebrać zawiesinę do probówki. Odwirować i usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić mikroglej w pożywce niezawierającej surowicy i przenieść na płytkę wielodołkową pokrytą kolagenem. Inkubować w celu ułatwienia adhezji mikrogleju.

Dodaj pożywkę z czynnikami wzrostu i lipidami. Inkubować w celu dojrzewania mikrogleju.

Po zebraniu mózgów w zimnym DPBS, posiekaj każdy mózg na jednomilimetrowe kawałki na szalce Petriego na lodzie za pomocą zimnego ostrza skalpela i przenieś do lodowatego homogenizatora Dounce z 5 do 7 mililitrami lodowatego buforu do rzucania. Następnie użyj luźno dopasowanego homogenizatora Dounce, aby zdysocjować tkankę za pomocą 10 do 20 delikatnych i niepełnych pociągnięć. Uważaj, aby nie zmiażdżyć bezpośrednio tkanki na dnie homogenizatora. Zamiast tego przepchnij tkankę przez przestrzeń między bokami tłoka a homogenizatorem.

Ważne jest, aby powoli homogenizować tkankę za pomocą wielu rund doskoku, aby zachować żywotność mikrogleju.

Następnie ostrożnie wyjmij tłok, aby zapobiec wprowadzaniu pęcherzyków powietrza. Pozwól, aby słabo zdysocjowane kawałki tkanki osiadły na dnie homogenizatora i przenieś supernatant do nowej, schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie zastąp usuniętą objętość świeżym buforem do douncji i powtórz procedurę dysocjacji, w sumie trzy do czterech rund lub do momentu, gdy cała tkanka zostanie zdysocjowana.

W tej procedurze dodaj lodowaty bufor do zanurzania do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej zawiesinę komórek i dostosuj całkowitą objętość do 33,5 mililitra. Następnie dodaj 10 mililitrów MSB do zawiesiny komórek i dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Spowoduje to 23% końcowe stężenie MSB w objętości 43,5 mililitra.

Następnie odwiruj komórki przez 15 minut w 500 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza z powolnym hamowaniem. Następnie usuń górną warstwę mieliny, zanieczyszczenia i supernatant za pomocą pipety. Zachowaj ostrożność podczas zdejmowania wierzchniej warstwy, aby upewnić się, że jak najwięcej z niej zostało usunięte.

Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 12 mililitrach buforu do płukania. Delikatnie rozetrzeć zawiesinę komórkową, aby rozbić wszelkie pozostałe grudki komórek. Na tym etapie przepuść zawiesinę komórek przez sitko o długości 70 mikrometrów, aby usunąć duże zanieczyszczenia lub grudki komórek. Opłucz naczynie do patelni pokryte OX42 trzykrotnie za pomocą DPBS. Nie pozwól, aby talerz całkowicie wyschł między praniami.

Odlej ostatnie płukanie DPBS i nałóż przefiltrowaną zawiesinę komórkową na naczynie do płukania. Delikatnie zakręć płytką, aby rozprowadzić komórki. Następnie inkubować płytkę na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby komórki mogły przylegać. Nie inkubuj dłużej niż 20 minut, w przeciwnym razie komórki staną się bardzo trudne do odzyskania z naczynia. Następnie opłucz naczynie do patelni DPBS 10 razy, aby usunąć nieprzylegające komórki.

Mikroglej będzie mocno przymocowany do płytki, więc obracaj płytkę przy każdym płukaniu, aby zapewnić usunięcie innych nieprzylegających komórek. Odlej ostatnie mycie DPBS i zastąp 15 mililitrami DPBS i 200 mikrolitrami trypsyny.

Aby wytrypsynizować komórki, inkubuj naczynie przez mniej niż lub równe 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 10 minutach trypsynizacji mikroglej nadal będzie przyklejony do płytki. Odlej mieszaninę i delikatnie umyj płytkę dwa razy DPBS, aby usunąć trypsynę. Następnie zastąp 12 mililitrami lodowatego MGM.

Następnie umieść naczynie do garnkowania na lodzie na dwie minuty, aby osłabić interakcję komórek i substratu, i upewnij się, że naczynie jest płaskie, aby zapobiec wysychaniu obszarów naczynia do patelni. Następnie energicznie pipetuj za pomocą 10-mililitrowej pipety i kontrolera pipet na wysokich obrotach, aby odzyskać komórki z naczynia do płukania. Narysuj siatkę 16 na 16 ze strumieniem płynu z pipety, aby spróbować usunąć wszystkie komórki.

Ważne jest, aby znaleźć równowagę między ogólną regeneracją komórek a zdrowiem hodowli. Wielokrotne pipetowanie supernatantu komórkowego na szalkę do płukania spowoduje zmniejszenie żywotności hodowli.

Sprawdź komórki pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że odczepiły się od płytki. Zaznacz miejsca na wierzchu naczynia, w których utknęły komórki i powtórz pipetowanie w tych miejscach. Zebrać zawiesinę komórek i podwielokrotność 3 do 4 mililitrów supernatantu w każdej 15-mililitrowej stożkowej probówce. Wiruj przez 15 minut w 500 g w 4 stopniach Celsjusza z powolnym hamowaniem.

Po 15 minutach odessać supernatant, pozostawiając 0,5 mililitra MGM z osadem komórkowym. Następnie ponownie zawieś każdą granulkę w pozostałym MGM i połącz komórki ze wszystkich probówek. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru.

Teraz umieść 15 mikrolitrów kolagenowej powłoki dożylnej bezpośrednio w środku 24-dołkowej anionowej, pokrytej kationami płytki do hodowli tkankowej i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zliczeniu komórek hemocytometrem rozcieńczyć je do 2,3 x ^10-5 na mililitr w MGM. Odessać plamkę dożylną kolagenu i natychmiast umieścić 15 mikrolitrów zawiesiny komórkowej w tym miejscu, aby uzyskać 3,5 x 10³ komórek na plamkę.

Następnie inkubuj przez pięć do dziesięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby komórki mogły przylegać. Następnie delikatnie dodaj 500 mikrolitrów TIC o równowadze CO₂ do studzienki.