$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zacznij od odizolowanego mózgu. Szybko zanurz mózg we wstępnie schłodzonym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym lub aCSF, aby wstrzymać procesy metaboliczne.
aCSF zawiera NMDG, duży kation organiczny, który zmniejsza uszkodzenia i śmierć komórek nerwowych.
aCSF zawiera również HEPES, który utrzymuje pH i stężenie soli oraz zapobiega obrzękom i uszkodzeniom komórek.
Przenieś mózg na szalkę Petriego zawierającą bibułę filtracyjną.
Przytnij mózg, aby uzyskać pożądany obszar.
Zamocuj blok mózgu w uchwycie na próbkę za pomocą odpowiedniego kleju i zanurz go w agarozie.
Umieść uchwyt próbki w krajalnicy.
Napełnij zbiornik krajalnicy wstępnie schłodzonym aCSF i napowietrzaj roztwór, aby zapewnić optymalny dopływ tlenu.
Uzyskaj skrawki bloku mózgowego.
Przenieś skrawki do wstępnie podgrzanego płynu mózgowo-rdzeniowego, aby wznowić procesy metaboliczne, umożliwiając skrawkom regenerację.
Delikatnie zgarnij nienaruszony mózg do zlewki z wstępnie schłodzonym NMDG-HEPES aCSF i pozwól mózgowi równomiernie ostygnąć przez około 1 minutę. Teraz użyj dużej szpatułki, aby przenieść mózg ze zlewki na szalkę Petriego, pokrytą bibułą filtracyjną.
Przytnij i zamontuj mózg zgodnie z preferowanym kątem krojenia i pożądanym obszarem mózgu, który Cię interesuje. Pracuj szybko, aby uniknąć długotrwałego niedoboru tlenu podczas przenoszenia. Następnie przymocuj blok mózgu do uchwytu próbki za pomocą kleju klejącego.
Cofnij wewnętrzną część uchwytu próbki, aby całkowicie wycofać blok mózgu do środka. Następnie wlej stopioną agarozę bezpośrednio do uchwytu, aż blok mózgu zostanie całkowicie pokryty agarozą. Następnie zacisnąć wstępnie schłodzony dodatkowy blok chłodzący wokół uchwytu próbki przez 10 sekund, aż agaroza zastygnie.
Włóż uchwyt próbki do pojemnika w krajalnicy i sprawdź prawidłowe wyrównanie. Następnie napełnij zbiornik pozostałym wstępnie schłodzonym, natlenionym NMDG-HEPES aCSF z 250-mililitrowej zlewki i umieść kamień bąbelkowy w zbiorniku na czas krojenia, aby zapewnić odpowiednie natlenienie.
Następnie wyreguluj mikrometr, aby rozpocząć przesuwanie próbki mózgu zanurzonej w agarozie. Uruchom krajalnicę i empirycznie dostosuj zaawansowaną prędkość i częstotliwość oscylacji do żądanego poziomu. Kontynuuj posuwanie się naprzód i krojenie tkanki w odstępach co 300 mikrometrów, aż obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania zostanie w pełni wycięty. Całkowity czas procedury krojenia powinien być krótszy niż 15 minut.
W celu wstępnego odzyskania NMDG, po zakończeniu procedury cięcia, należy zebrać wszystkie plastry za pomocą odciętej plastikowej pipety Pasteura i przenieść je do komory odzyskiwania o temperaturze 34 stopni Celsjusza, wypełnionej 150 mililitrami NMDG-HEPES aCSF.
Czas etapu regeneracji ostrego wycinka mózgu jest bardzo ważny, aby móc osiągnąć równowagę między zachowaniem morfologicznym a funkcjonalnym przywróceniem właściwości elektrofizjologicznych każdego neuronu.