JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 5:31 min. • July 8th, 2025
Zacznij od mózgu myszy na schłodzonej matrycy mózgowej.
Uzyskaj przekroje zawierające strefę podmodzelową lub SCZ. Przenieść sekcję do zimnego bufora fosforanowego.
Pod mikroskopem preparacyjnym wytnij część SCZ.
Pokrój rozciętą SCZ na mniejsze kawałki.
Przenieś te kawałki do buforu do wytrawiania. Inkubować, aby oddzielić komórki od tkanki.
Odwirować i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w odpowiednim podłożu.
Przenieś komórki na płytkę hodowlaną i dodaj określone czynniki wzrostu.
Dorosłe nerwowe komórki macierzyste dzielą się, tworząc skupiska zwane neurosferami.
Niewłaściwa dystrybucja składników odżywczych w skupiskach komórkowych ogranicza wzrost komórek.
Aby rozproszyć skupiska, odwirować i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić klastry w buforze dysocjacyjnym i inkubować.
Pipetować roztwór w górę i w dół, aby wytworzyć pojedyncze komórki.
Odwirować i wyrzucić supernatant.
Ponownie zawiesić komórki i przenieść je do odpowiedniego podłoża, aby uzyskać monowarstwę.
Po wypreparowaniu przenieś mózg myszy do zimnego buforu PBS i przepłucz go dwukrotnie, aby usunąć nadmiar krwi. Następnie umieść mózg w macierzy mózgowej na lodzie i wykonaj nacięcia koronalne, aby uzyskać plastry o grubości jednego milimetra. Następnie przenieś tylne wycinki mózgu zawierające regiony SCZ do zimnego PBS.
Pod mikroskopem preparacyjnym o małym powiększeniu przeprowadź mikrosekcję SCZ z obszaru istoty białej kory i hipokampa za pomocą wygiętej igły o rozmiarze 30. Następnie usuń obszary kory powyżej SCZ i umieść wycięty SCZ w zimnym PBS na 35-milimetrowej szalce Petriego na lodzie.
Obszar strefy podmodzelowej można precyzyjnie wypreparować z całej tkanki za pomocą macierzy mózgowej i wygiętej igły o rozmiarze 30.
Następnie usuń PBS, a następnie natychmiast posiekaj wypreparowane tkanki na małe kawałki. Ponownie zawiesić je jednym mililitrem buforu wytrawiającego. Następnie przenieś próbkę do 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry buforu wytrawiającego. Następnie inkubuj go przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Na tym etapie delikatnie postukaj w probówkę, aby oddzielić strawioną tkankę, a następnie odwiruj probówkę z prędkością 145 razy g przez pięć minut. Po pięciu minutach wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić strawioną tkankę za pomocą jednego mililitra wstępnie podgrzanego i dwóch pożywek w celu wypłukania buforu wytrawiającego i delikatnie odpipetować roztwór próbki maksymalnie pięć razy.
Następnie ponownie odwirować próbkę w temperaturze 145 razy g przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze pożywki N2. Umieść jeden mililitr pożywki N2 na niepowlekanej płytce sześciodołkowej i dodaj jeden mililitr zawieszonych komórek, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów.
Następnie dodaj 20 nanogramów na mililitr EGF i 20 nanogramów na mililitr bFGF do każdej studzienki. Delikatnie potrząśnij ręcznie sześciodołkową szalką hodowlaną, aby wymieszać dodane czynniki wzrostu z posianymi komórkami. Następnie trzymaj sześciodołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Dodaj 20 nanogramów na mililitr EGF i 20 nanogramów na mililitr bFGF do każdej studzienki codziennie przez osiem dni. Co trzeci dzień dodawaj 200 mikrolitrów pożywki N2, aby utrzymać około dwóch mililitrów pożywki. Oto obraz neurosfer po ośmiu dniach.
W tej procedurze zbierz neurosfery i przenieś je do nowej 15-milimetrowej stożkowej rurki. Odwirować probówkę z prędkością 145 razy g przez pięć minut. Następnie odrzuć supernatant i ponownie zawieś neurosfery za pomocą 0,5 mililitra buforu dysocjacyjnego. Inkubuj je z 0,5 mililitra buforu dysocjacyjnego przez pięć minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zdysocjować neurosfery na pojedyncze komórki.
Delikatnie odpipetować roztwór próbki w górę i w dół mniej niż pięć razy i odwirować probówkę z ciśnieniem 145 razy g przez pięć minut. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś neurosfery jednym mililitrem pożywki N2. Po pokryciu sześciodołkowej płytki lamininą PLL, płytkie komórki w proporcji 2,5 x 105 komórek na mililitr z dwoma mililitrami pożywki N2 na dołek. Utrzymuj dorosłe nerwowe komórki macierzyste SCZ za pomocą codziennego leczenia czynnikami wzrostu przez pięć dni przed ich przepasaniem.