Izolowanie komórek odpornościowych naciekających nowotwór z mysiego mózgu

Weźmy perfundowany mózg myszy zawierający guz.

Etap perfuzji usuwa krążące komórki odpornościowe, ale zachowuje komórki naciekane przez nowotwór.

Odizoluj tkankę zawierającą guz.

Teraz mechanicznie oddziel tkankę.

Siła mechaniczna rozluźnia tkankę, uwalniając komórki.

Przenieś zdysocjowaną tkankę do probówki.

Odwirować i wyrzucić sklarowany osad zawierający zanieczyszczenia.

Ponownie zawiesić tkankę w roztworze trawiącym zawierającym kolagenazę i DNazę.

Kolagenaza degraduje macierz zewnątrzkomórkową, uwalniając komórki. DNaza degraduje zanieczyszczające DNA.

Dodaj bufor, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.

Przefiltrować zawiesinę, aby usunąć agregaty komórkowe i uzyskać zawiesinę jednokomórkową.

Odwirować i wyrzucić supernatant.

Zawieś ponownie komórki w ośrodku o gradiencie o dużej gęstości. Teraz nałóż na siebie medium gradientowe o mniejszej gęstości, tworząc gradient separacji z przejrzystym interfejsem.

Odwirować do oddzielnych warstw. Komórki odpornościowe gromadzą się na styku ośrodków gradientowych, podczas gdy szczątki komórkowe unoszą się na wierzchu.

Zbierz komórki odpornościowe do dalszej analizy.

W tej procedurze, używając czystej, jednosiecznej żyletki, wyizoluj obszar mózgu, w którym znajduje się guz, wykonując strzałkowe cięcie w środku mózgu, aby przeciąć dwie półkule. Odwróć półkulę ipsilateralną przyśrodkową w dół i wykonaj jedno nacięcie koronalne na móżdżku, a drugie nacięcie na opuszce węchowej, aby wyizolować tkankę docelową zawierającą implant nowotworowy.

Następnie umieść docelową tkankę w oznakowanym młynku do tkanek ze szkła, zawierającym 1 mililitr DPBS. Wciśnij tłok do końca w dół i przekręć go siedem razy, aby przerwać działanie tkanki. Następnie podnieś tłok, aby płyn opadł z powrotem na dno młynka do tkanek. Powtórz ten krok trzy razy. Jednak przekręć tłok tylko cztery razy podczas następnych dwóch powtórzeń i trzy razy podczas ostatniego powtórzenia, aby uniknąć nadmiernego rozdrobnienia tkanki mózgowej.

Następnie nałóż trzy 1-mililitrowe objętości lodowatego DPBS na boki tłoka, aby wypłukać resztki materii mózgowej do młynka do tkanek. Następnie ponownie zawieś rozdrobnioną materię mózgową, pipetując w górę iw dół, i umieść w oznakowanej 15-mililitrowej probówce wirówkowej na lodzie. Opłucz boki młynka do tkanek DAPS dodatkowym 1 mililitrem lodowatego DPBS i dodaj do tej samej 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Trzymaj wszystkie probówki zawierające rozdrobnioną materię mózgową na lodzie, dopóki wszystkie próbki nie zostaną przetworzone. Następnie odwiruj rozdrobnioną materię mózgową w 15-mililitrowych probówkach wirówkowych o temperaturze 740 razy g przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulowaną materię mózgową w 1 mililitrze wcześniej przygotowanej mieszaniny kolagenazy i enzymów trawiennych DNazy I.

Umieść 15-mililitrowe probówki wirówkowe w stojaku na probówki i umieść stojak w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut, a następnie delikatnie mieszaj próbki dwukrotnie w okresie inkubacji, przesuwając probówki, aby ułatwić dezagregację tkanek.

Następnie dodaj 6 mililitrów lodowatego DPBS do każdej tubki, aby rozcieńczyć enzymy trawienne. Pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić, i przefiltruj całkowitą objętość przez sterylne filtry z siatki nylonowej o grubości 70 mikronów do nowych, oznakowanych 15-mililitrowych probówek wirówkowych na lodzie.

Następnie obracaj zawiesinę komórek mózgowych w dół z prędkością 740 razy g przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby uzyskać jednokomórkową osadkę. Wyjmij 15-mililitrowe probówki z wirówki i umieść je na lodzie. Następnie zwiększ ustawienie temperatury na wirówce do około 21 stopni Celsjusza, przygotowując się do następnego kroku.

Następnie całkowicie usuń supernatant komórek i wstępnie ponownie zawieś granulki komórek w 1 mililitrze pożywki wirowej o gęstości 70%, używając mikropipety P1000. Następnie dodaj cztery dodatkowe mililitry pożywki wirówkowej o gęstości 70% do każdej probówki. Załóż bezpiecznie nakrętki i homogenizuj zawiesinę komórek, delikatnie odwracając probówkę kilka razy.

Następnie przenieś 15-mililitrowe probówki wirówkowe, zawierające komórki mózgowe zawieszone w pożywce wirowej o gęstości 70% z lodu do probówki z powrotem w temperaturze pokojowej. Pojedynczo ostrożnie nałóż 2 mililitry roztworu pożywki wirowej o gęstości 37% na 5 mililitrów pożywki wirowej o gęstości 70%, aby utworzyć czysty interfejs między dwiema warstwami pożywki wirówkowej o gęstości.

Następnie zaznacz położenie granicy faz między dwiema warstwami markerem z cienką końcówką, aby można było ją łatwo zidentyfikować po odwirowaniu, gdy różnica staje się mniej widoczna. Wirować 15-mililitrowe probówki wirówkowe pod ciśnieniem 740 razy g przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy, aby uniknąć przerwania interfejsu między warstwami pożywki wirującej o dużej gęstości.

Następnie zbierz PBMC, które nagromadziły się na granicy faz między dwiema warstwami pożywki wirującej o dużej gęstości, wprowadzając mikropipetę P200 do probówki, ostrożnie omijając warstwę lipidową. Będąc na poziomie pasma PBMC, powoli wyekstrahuj 200 mikrolitrów z powierzchni warstwy pożywki wirówkowej o gęstości 70% i przenieś do odpowiednio oznakowanej probówki FACS z polipropylenu na lodzie. Powtórz ten krok raz, aby uzyskać całkowitą objętość 400 mikrolitrów na próbkę.