Stworzenie trójwymiarowej hodowli komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura

Weź mikropłytkę z przylegającą kulturą komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura. Kultura zawiera astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty.

Usuń pożywkę, inkubuj z roztworem enzymu, aby odłączyć komórki, a następnie przenieś je do probówki.

Odwirować i usunąć supernatant z resztkami komórkowymi. Ponownie zawieś komórki w ciepłym podłożu.

Rozcierać za pomocą strzykawki w celu rozbicia grudek komórek i przefiltrować za pomocą sitka w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.

Dodaj fotosieciowalny biopolimer, środki sieciujące i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej.

Wlej masę do formy przymocowanej do szkiełka nakrywkowego. Wystaw mieszaninę na działanie światła o dużym natężeniu, aby wywołać sieciowanie, tworząc żel i otaczając komórki glejowe.

Wyjmij formę i umieść szkiełka nakrywkowe w mikropłytce. Dodaj ciepłe podłoże i inkubuj żel w warunkach fizjologicznych.

Komórki namnażają się w nośnej macierzy zewnątrzkomórkowej i tworzą sieć komórkową, tworząc trójwymiarową kulturę komórek glejowych.

24 godziny przed enkapsulacją komórek odessać pożywkę z dwutygodniowych kultur pierwotnych i dodać 1 mililitr świeżej pożywki do każdej studzienki. W dniu enkapsulacji komórek przygotuj 12,5 mililitra rozcieńczonej trypsyny i 25 mililitrów pożywki na każdą 12-dołkową płytkę i podgrzej do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Następnie użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby dodać około 1 mililitra rozcieńczonej trypsyny do każdego dołka 12-dołkowej płytki.

Inkubować przez 20 do 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż zlewająca się warstwa komórek oderwie się od płytki. Po inkubacji użyj 1-mililitrowej pipety, aby odzyskać oderwane komórki, które powinny wyglądać jak pojedynczy pływający kawałek, i przenieś do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Rozcieńczyć równoważną objętością pożywki i odwirować 200 razy g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach ciepłego podłoża. Roztrzeć komórki pięć razy za pomocą pipety, a następnie ponownie odwirować przy 200 razy g przez dwie minuty. Po wirowaniu zdekantować supernatant, ponownie zawiesić komórki w 5 mililitrach ciepłego podłoża i przenieść komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej.

Następnie, za pomocą 10-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 18, trzykrotnie rozcieraj roztwór komórek i filtruj zawiesinę przez sito komórkowe o średnicy 40 mikronów do nowej stożkowej probówki wirówkowej. Następnie zbierz 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i rozcieńcz od 1 do 100 w ciepłym podłożu i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.

Pozostałe komórki inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do etapu enkapsulacji. Ciepła 12,5 mililitra naiwnego podłoża i 12,5 mililitra kondycjonowanej pożywki na każdą roślinną 12-dołkową płytkę hydrożeli 3D. Następnie odważyć 7 miligramów HAMA na 12-dołkową płytkę roślinną i dodać do sterylnego przefiltrowanego do stężenia 2% wagowo w stosunku do objętości. Sonikować roztwór przez 60 minut w temperaturze 20 kiloherców, aż do całkowitego rozpuszczenia HAMA.

Podczas sonikacji przygotuj indywidualne 10% roztwory zarówno herbaty, jak i NVP. Przygotuj również 1-milimolowy roztwór eozyny w 1-mililitrowych podwielokrotnościach sterylnego PBS. Następnie, dla każdej 12-dołkowej płytki, przygotuj końcową 1,4 1,4-mililitrową mieszaninę 1 x^{10 7} komórek, 0,5% HAMA, 20% mieszaniny blaszki podstawowej w PBS, 0,1% TEA, 0,1% NVP i 0,01 milimolowej eozyny Y.

Po delikatnym wymieszaniu roztworu użyj pipety wyposażonej w końcówkę o pojemności 1 mililitra, aby dozować 100 mikrolitrów do każdej formy PDMS. Następnie wystaw próbki na działanie zielonego światła LED o dużej intensywności w zamkniętym pudełku przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

Pięciominutowa ekspozycja na zieloną diodę LED jest niezbędna do utworzenia żelu 3D. Czerwony kolor wprowadzony przez eozynę Y stanie się przezroczysty i wskaże zakończenie reakcji.

Następnie dodaj 1 mililitr ciepłego, kondycjonowanego podłoża do każdego dołka 12-dołkowej płytki; chwyć każde szkiełko nakrywkowe między kciukiem a palcem wskazującym i użyj zakrzywionej pęsety, aby powoli odkleić formę PDMS bez przesuwania żelu. Umieść formę w studzience z kondycjonowanym podłożem.

Usunięcie formy jest najtrudniejszym krokiem. Należy to zrobić z najwyższą ostrożnością, aby zapobiec przemieszczeniu się żelu i pęknięciu szkiełka nakrywkowego. Może to wymagać praktyki.

Po przeniesieniu wszystkich form do dołków płytki, dodaj dodatkowy 1 mililitr ciepłego podłoża DMEM/F12 do każdej studzienki. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwa tygodnie przed obrazowaniem.