JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:16 min. • July 8th, 2025
Weź płytkę wielodołkową pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową lub ECM.
Do oddzielnych studzienek wprowadzić nietransgeniczne i transgeniczne ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste lub hPSC do pożywki hodowlanej.
Transgeniczne hPSC przenoszą transgen pod promotorem indukowanym antybiotykami. Transgen koduje czynnik transkrypcyjny, który indukuje różnicowanie neuronalne.
Inkubować w celu ułatwienia przylegania komórek do ECM. Małe cząsteczki w pożywce zapobiegają apoptozie, sprzyjając proliferacji komórek.
Dodaj roztwór odłączający, aby dysocjować komórki; dodaj pożywkę, aby zatrzymać dysocjację, a następnie przenieś je na inną mikropłytkę pokrytą ECM, aby umożliwić proliferację komórek.
Wprowadzić pożywkę różnicowania neuronalnego zawierającą małe cząsteczki do komórek nietransgenicznych, a antybiotyk induktor do komórek transgenicznych.
Małe cząsteczki indukują nietransgeniczne komórki do różnicowania się w neuronalne komórki progenitorowe lub NPC. W komórkach transgenicznych indukowana antybiotykiem ekspresja czynnika transkrypcyjnego aktywuje geny wymagane do różnicowania się w NPC.
Utrzymuj NPC w kulturze dla dalszych zastosowań.
Aby uzyskać informacje na temat generowania nietransgenicznych neuronalnych progenitorów i neuronów lub hNeuronów, zobacz dzień 14 neuronalnych progenitorów pochodzących z hPSC na sześciodołkowych płytkach pokrytych ECM z 2 mililitrami pożywki neuronowej i Y27632 na dołek.
Jeśli pracujesz z iNeuronami indukowanymi doksycykliną, dodaj pożywkę neuronową zawierającą doksycyklinę, gdy komórki są w około 35% zlewne, aby indukować różnicowanie i aktywować ekspresję genów. Po dwóch dniach nakarm linie transgeniczne i nietransgeniczne 2 mililitrami pożywki neuronowej na studzienkę dziennie. Kontynuuj, aż komórki będą gotowe do podniesienia przy 70% zbieganiu.