JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:49 min. • July 8th, 2025
Weź naczynie hodowlane zawierające łódź z mikrokolumną składającą się z wydrążonych rurek o określonej średnicy.
Mikrokolumny, wykonane z hydrożelu, są wypełnione buforem, aby zapobiec wysuszeniu.
Pod mikroskopem stereoskopowym usuń bufor i dodaj lodowaty roztwór kolagenu, składnik macierzy zewnątrzkomórkowej.
Wprowadź pożywkę wzdłuż wewnętrznej krawędzi naczynia, aby utrzymać nawodnienie kolumny. Inkubuj w warunkach fizjologicznych, aby kolagen mógł się spolimeryzować, tworząc powłokę wewnątrz mikrokolumn.
Dodaj astrocyty do wnętrza mikrokolumn i inkubuj, aby promować adhezję astrocytów do kolagenu.
Następnie napełnij naczynie pożywką i utrzymuj je w warunkach fizjologicznych.
Ze względu na wąską średnicę mikrokolumn astrocyty uzyskują dwubiegunową morfologię z procesami rozciągającymi się wzdłuż długości.
Z biegiem czasu astrocyty samoorganizują się, tworząc trójwymiarowe rusztowanie zawierające gęste wiązki procesów astrocytów.
Rusztowanie astrocytów w obudowie hydrożelowej jest gotowe do dalszych testów.
Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego przygotuj 1 miligram na mililitr roztworu kolagenu typu I z ogona szczura w pożywce do kohodowli, a następnie umieść go na lodzie. W razie potrzeby dostosować pH roztworu ECM za pomocą kwasu lub zasady, aż pH ustabilizuje się w zakresie od 7,2 do 7,4. Przenieś łódkę z mikrokolumną na 35- lub 60-mililitrową szalkę Petriego za pomocą kleszczy. Korzystając ze stereoskopu jako wskazówek, umieść 10-mikrolitrową końcówkę mikropipety na jednym końcu każdej mikrokolumny i odsysaj, aby opróżnić światło DPBS i pęcherzyki powietrza.
Naładuj mikropipetę P10 roztworem kolagenu. Umieść końcówkę o pojemności 10 mikrolitrów na jednym końcu każdej mikrokolumny i dostarcz wystarczającą ilość roztworu, aby wypełnić światło, a następnie pipetuj zbiornik ECM na obu końcach mikrokolumny. Po napełnieniu wszystkich kolumn należy odpipetować pożywkę do współhodowli w pierścieniu wokół szalki Petriego, aby zapobiec wysychaniu kolumn.
Inkubuj naczynie zawierające mikrokolumny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej godzinę, aby przyspieszyć polimeryzację kolagenu przed dodaniem komórek. Następnie umieść końcówkę mikropipety P10 na jednym końcu mikrokolumny i przenieś około 5 mikrolitrów roztworu komórkowego do światła, aby go napełnić. Po umieszczeniu wszystkich mikrokolumn w łodzi, inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez jedną godzinę, aby promować przyczepianie astrocytów do ECM.
Po okresie inkubacji ostrożnie napełnij szalki zawierające mikrokolumny z nasionami 3 lub 6 mililitrów pożywki do kokultury odpowiednio na 35 lub 60-milimetrowe szalki Petriego. Utrzymuj platerowane mikrokolumny w kulturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby promować samoorganizację wyrównanych wiązek astrocytów, które powinny utworzyć wiązkę przypominającą strukturę po 6 do 10 godzinach.