Replikacja zróżnicowanych neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Zacznij od dużej płytki hodowlanej zawierającej ludzkie pluripotencjalne zróżnicowane neurony pochodzące z komórek macierzystych z gęstą siecią neuronalną.

Inkubuj te neurony za pomocą łagodnych enzymów proteolitycznych, aby oderwać je od płytki, podnosząc je jako prześcieradło.

Przy ciągłej inkubacji enzymy częściowo przerywają połączenia komórkowe, rozluźniając sieci neuronowe.

Dodaj pożywkę hodowlaną, aby zatrzymać aktywność enzymu.

Kilkakrotnie pipetuj odłączone neurony, aby oddzielić je od siebie.

Przefiltruj neurony przez sitko komórkowe, aby usunąć grudki komórek i zebrać poszczególne neurony.

Odwirować i usunąć supernatant. Zawieś je ponownie w pożywce wzrostowej.

W celu ponownego posiewu umieść te neurony na polimerze i płytce wielodołkowej pokrytej białkiem adhezyjnym. Inkubuj, aby umożliwić ich przywiązanie.

Neurony wykorzystują składniki odżywcze z pożywki, aby zachować żywotność. Regularnie wymieniaj pożywkę hodowlaną, aby utrzymać poziom składników odżywczych.

Inkubuj dalej, aby umożliwić dojrzewanie neuronów i tworzenie połączeń między nimi.

Zacznij od delikatnego przepłukania płytki zróżnicowanych neuronów za pomocą PBS. Rozprowadź PBS wzdłuż ścianki płytki, a nie bezpośrednio na komórkach, aby uniknąć ich zakłócenia. Zasysaj PBS od krawędzi naczynia, przechylając je, uważając, aby nie dotknąć komórek.

Zastosuj co najmniej 1 mililitr enzymu proteolitycznego na 10-centymetrową płytkę i włóż komórki z powrotem do inkubatora na 40 do 45 minut. Podczas inkubacji sprawdź neurony pod mikroskopem z kontrastem fazowym i kontynuuj leczenie proteazą, aż sieć neuronowa całkowicie odłączy się od płytki i zacznie się rozpadać. Kiedy neurony się odłączą, przerwij trawienie, dodając 5 mililitrów świeżej pożywki DMEM na każdy 1 mililitr proteazy.

Użyj pipety serologicznej, aby delikatnie rozcierać komórki o płytkę od 5 do 8 razy, uważając, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku. Przecedź komórki przez siatkę o długości 100 mikrometrów do 50-mililitrowej stożkowej rurki kropla po kropli i przepłucz sitko dodatkowymi 5 mililitrami świeżej pożywki DMEM.

Użyj wirówki stołowej, aby odwirować komórki z prędkością 1,000 g przez 5 minut. Po odwirowaniu włóż stożkową rurkę z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odessaj większość pożywki, pozostawiając 250 mikrolitrów, aby komórki były wilgotne. Delikatnie zawieś komórki w 2 mililitrach świeżej pożywki DMEM i przepuść je przez koniec 5-mililitrowej pipety serologicznej.

Na koniec odwróć rurkę 2 do trzech razy. Użyj hemocytometru i błękitu trypanowego, aby policzyć żywe komórki, a następnie rozcieńczyć komórki świeżym DMEM do pożądanego stężenia. Dodaj odpowiednie suplementy do probówki w zależności od wymagań konkretnej linii komórkowej i delikatnie wymieszaj komórki, przechylając stożkową rurkę 2 do 3 razy.

Odessać powłokę lamininy z płytki 24-dołkowej i przepłukać ją raz PBS. Zassać PBS i nałożyć roztwór komórek do każdej studzienki ruchem ósemkowym, aby uniknąć zbrylania. Po zakończeniu powlekania komórek włóż płytkę z powrotem do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.