Opracowywanie ludzkich organoidów nerwów ruchowych pochodzących z iPSC przy użyciu chipa mikroprzepływowego

Weźmy ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub iPSC w bogatej w składniki odżywcze pożywce z komórkami macierzystymi z inhibitorami kinazy Rho.

Inhibitory wnikają do komórek i blokują enzymy kinazy Rho, zapobiegając apoptotycznej śmierci komórki.

Komórki wykorzystują składniki odżywcze do namnażania się i spontanicznej agregacji, tworząc trójwymiarowy klaster komórek zwany sferoidą.

Stopniowo zastąp pożywkę pożywką do indukcji neuronalnej. Modulatory sygnalizacyjne z pożywki napędzają różnicowanie komórek macierzystych w komórki nerwowe.

Zastąp pożywką neuronalną bogatą w czynnik wzrostu, aby zróżnicować komórki sferoidalne w neurony ruchowe i utworzyć sferoidę neuronu ruchowego lub MNS.

Przenieść te MNS do pokrytego polimerem chipa mikroprzepływowego zawierającego pożywkę dojrzewającą.

Czynniki wzrostu nerwów w pożywce stymulują aksony lub dłuższe wypustki neuronów do wzrostu ze sferoidy i rozciągania się przez mikrokanał chipa.

W ten sposób powstaje organoid nerwu ruchowego, trójwymiarowy model tkanki nerwu ruchowego.

Aby indukować różnicowanie komórek 3D iPS w neuronach ruchowych, zasiaj 4 x 10⁴ komórek iPS na studzienkę do odpowiedniej liczby dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U w 100 mikrolitrach pożywki do hodowli komórek bez surowicy i surowicy uzupełnionej 10 mikromolami Y27632.

Następnego dnia zastąp supernatant w każdej studzience 100 mikrolitrami pożywki KSR uzupełnionej 10 mikromolami SB-431542 i 100 nanomolowymi LDN-193189. W dniach 2 i 3 zastąp supernatanty 100 mikrolitrami pożywki KSR uzupełnionej 10 mikromolami SB-431542, 100 nanomolami LDN-193189, 5 mikromolowymi DAPT, 5 mikromolowymi SU-5402, 1 mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonym agonistą. W dniach 4 i 5 zastąp supernatanty mieszaniną 75% pożywki KSR i 25% pożywki N2, uzupełnioną 10 mikromolowymi SP-431542, 100 nanomolowymi LDN-193189, 5 mikromolowymi DAPT, 5 mikromolowymi SU-5402, 1 mikromolowym kwasem retinowym i 1 mikromolowym wygładzonym agonistą.

W dniach 6 i 7 zastąp supernatanty mieszaniną 50% pożywki KSR i 50% pożywki N2, uzupełnioną 5 mikromolowymi DAPT, 5 mikromolowymi SU-5402, 1 mikromolowym kwasem retinowym i 1 mikromolowym wygładzonym agonistą. W dniach 8 i 9 zastąp supernatanty mieszaniną 25% pożywki KSR i 75% pożywki N2, uzupełnioną 5 mikromolowymi DAPT, 5 mikromolowymi SU-5402, 1 mikromolowym kwasem retinowym i 1 mikromolowym wygładzonym agonistą. W dniach 10 i 11 zastąp supernatanty pożywką N2 uzupełnioną 5 mikromolowymi DAPT, 5 mikromolowymi SU-5402, 1 mikromolowym kwasem retinowym i 1 mikromolowym wygładzonym agonistą. W dniu 12 zastąp supernatanty w każdym dołku 100 mikrolitrami pożywki dojrzewającej, uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego na studzienkę.

Aby indukować tworzenie organoidów nerwów ruchowych, zastąp roztwór powlekający w chipie PDMS 150 mikrolitrami pożywki dojrzewającej uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego i użyj końcówki mikropipety o szerokim otworze, aby delikatnie dodać sferoidy neuronów ruchowych z jednego dołka 96-dołkowej płytki do wlotu mikrokanału chipa. Umieść mały zbiornik sterylnej wody w pobliżu chipa do hodowli tkankowej w naczyniu, aby zapobiec parowaniu pożywki, i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Co dwa do trzech dni zastępować połowę wyczerpanej pożywki hodowlanej ze środka zbiornika pożywki świeżą pożywką dojrzewającą uzupełnioną 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego. Aksony będą rosły od sferoidy neuronu ruchowego do kanału, spontanicznie łącząc się w pojedynczą wiązkę w ciągu dwóch do trzech tygodni, tworząc organoid nerwu ruchowego.