Generowanie progenitorów nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy metodą wiszącej kropli

Weźmy zawiesinę embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Odwirować, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce różnicowania neuronów.

Umieścić kropelki zawiesiny po wewnętrznej stronie pokrywy płytki hodowlanej.

Dodaj bufor do dolnej płyty, aby zapobiec wysychaniu kropel. Umieść pokrywkę na dolnej płycie, tworząc wiszącą kulturę kroplową i inkubuj.

Ze względu na grawitację komórki grupują się i tworzą trójwymiarowe agregaty zwane ciałami embrionalnymi lub EB.

Umieścić kropelki na płytce zawierającej pożywkę różnicującą i inkubować pod wpływem mieszania w celu wzrostu EBs.

Odwirować i usunąć pożywkę; ponownie zawiesić EB w pożywce różnicującej uzupełnionej kwasem retinowym, przenieść je na płytkę hodowlaną i inkubować.

Kwas retinowy dostaje się do komórek i wyzwala tworzenie kompleksu transkrypcyjnego. Kompleks indukuje ekspresję genów, wywołując różnicowanie w neuronalne komórki progenitorowe.

Zróżnicowane EB są gotowe do dalszych zastosowań.

Zacznij od skonfigurowania hodowli komórek wiszących kroplowych. W przypadku 10-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej dostosuj stężenie do 500 komórek na 20 mikrolitrów pożywki różnicującej. Przygotuj wystarczającą ilość zawiesiny komórek na 50 kropelek o pojemności 20 mikrolitrów. Użyj mikropipety lub pipety powtarzalnej, aby umieścić 20-mikrolitrowe kropelki zawiesiny komórkowej na pokrywie płytki do hodowli tkankowej, upewniając się, że kropelki nie są zbyt blisko siebie, aby zapobiec ich łączeniu się.

Napełnij talerz 5 do 10 mililitrami PBS i ostrożnie połóż pokrywkę z powrotem na talerzu. Inkubuj kulturę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch dniach zbierz kropelki z pokrywki i umieść je na 10-centymetrowej płytce zawiesinowej do hodowli komórkowych, wypełnionej 10 mililitrami pożywki różnicującej. Następnie umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na niską prędkość w inkubatorze. Po kolejnych dwóch dniach odwirować komórki w ilości 200 razy g przez trzy minuty i usunąć supernatant.

Aby indukować różnicowanie ciała embrionalnego w nerwowe komórki progenitorowe, należy ponownie zawiesić komórki w pożywce różnicowej za pomocą 5-mikromolowego kwasu retinowego. Inkubuj płytkę przez dwa dni. Następnie zastąp co najmniej połowę pożywki świeżą pożywką, przechylając płytkę i odpipetowując ją.