JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:35 min • July 8th, 2025
Weźmy mały interferujący RNA lub siRNA, rodzaj RNA biorący udział w wyciszaniu genów.
Dodaj kuliste pęcherzyki lipidowe zwane liposomami.
Liposom otacza siRNA, chroniąc je przed degradacją.
Dodaj kompleksy siRNA-liposom do hodowli dobrze zawierającej nerwowe komórki macierzyste. Trzymaj jeden dobrze jako kontrolę i inkubuj.
Liposom łączy się z błoną komórkową, uwalniając siRNA.
SiRNA wiąże się z kompleksem wyciszającym indukowanym przez RNA lub RISC, w którym usuwana jest jedna nić.
Pozostała nić celuje w mRNA odpowiedzialne za różnicowanie komórek, prowadząc do ich degradacji.
Dodać odpowiednią pożywkę różnicującą do studzienek.
W studzience kontrolnej czynniki wzrostu i inne składniki odżywcze w pożywce sprzyjają różnicowaniu nerwowych komórek macierzystych w osteoblasty.
Stosując odpowiednie techniki barwienia, wybarwić markery specyficzne dla osteoblastów na komórkach i wybarwić jądro niebieskim barwnikiem fluorescencyjnym.
Brak markerów specyficznych dla osteoblastów w komórkach wyciszonych genami wskazuje na ich niezdolność do różnicowania.
Aby przeprowadzić knockdown siRNA w komórkach O9-1, odzyskaj i zasiej komórki. Rozcieńczyć liposomy w odpowiedniej objętości podłoża bez surowicy. Następnie rozcieńczyć siRNA w pożywce bez surowicy zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodaj rozcieńczone siRNA do rozcieńczonych liposomów zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszać roztwór, pipetując i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie należy dodać do komórek odpowiednią objętość kompleksu siRNA-lipid. Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych. Komórki O9-1 mogą różnicować się w różne typy komórek w określonych warunkach hodowli różnicowania. Aby zróżnicować komórki O9-1 w osteoblasty, należy przygotować osteogenne pożywki różnicujące zgodnie z protokołem tekstowym. Na koniec wykryj marker osteoblastów osteokalcynę w zróżnicowanych osteoblastach za pomocą barwienia immunologicznego.