JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:38 min. • July 8th, 2025
Rozpocznij od przylegającej hodowli indukowanych kolonii nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z dorosłych ludzkich fibroblastów na płytce wielodołkowej pokrytej lamininą.
Umyj kolonie buforem, aby usunąć nieprzylegające komórki, a następnie dodaj świeży bufor.
Zeskrob wokół poszczególnych kolonii, aby usunąć otaczające komórki.
Przenieś kolonie do świeżych studzienek pokrytych lamininą zawierających pożywkę neuroindukcyjną.
Mechanicznie zdezagregować kolonie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
Laminina, białko macierzy zewnątrzkomórkowej, oddziałuje z białkami powierzchniowymi komórek progenitorowych, ułatwiając przyleganie komórek do powierzchni studzienki.
Dodaj inhibitor drobnocząsteczkowy, który wnika do komórek i blokuje specyficzne kinazy białkowe, zapobiegając apoptozie komórkowej.
Czynniki wzrostu i małe cząsteczki obecne w pożywce neuroindukcyjnej ułatwiają proliferację komórek progenitorowych.
Okresowo wymieniaj pożywkę, aby uzupełnić składniki odżywcze, ułatwiając dalszą proliferację progenitorów.
Zlewająca się kultura lub w pełni pokryta warstwa komórkowa wskazuje na pomyślną ekspansję indukowanych nerwowych komórek progenitorowych.
Dzień później odessaj lamininę z płytek i dodaj 200 mikrolitrów pożywki do indukcji neuronów do studzienek. Umyj sześciodołkowe płytki zawierające kolonie, które mają zostać pobrane, raz za pomocą DPBS, przed dodaniem 2 mililitrów pożywki do indukcji neuronalnej na dołek sześciodołkowej płytki.
Mechanicznie wybieraj komórki, skrobając wokół kolonii za pomocą cienkiej igły, aby pozbyć się otaczających komórek, i zbierając kolonie za pomocą końcówek pipet zamontowanych na 200-mikrolitrowym pipecie ustawionym na 50 mikrolitrów.
Przenieś każdą kolonię do jednego dołka 48-dołkowej płytki pokrytej lamininą i wygeneruj mechanicznie zawiesinę jednokomórkową, pipetując w górę i w dół 10 razy. Dodaj inhibitor kinazy Rho w końcowym stężeniu 10 mikromolów do komórek. Hoduj komórki na 48-dołkowej płytce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 przez dwa dni. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną zbieżność od 80% do 90%.