JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:22 min • July 8th, 2025
Weź mysie embrionalne komórki macierzyste lub mESC, zawieszone w pożywce różnicującej i inkubuj.
W kulturze zawiesinowej mESC agregują się, tworząc strukturę zwaną ciałami embrionalnymi lub EB.
EB to trójwymiarowe agregaty, które naśladują rozwijający się zarodek i mogą różnicować się w komórki nerwowe.
Przenieś EB do rurki i pozwól im osiąść grawitacyjnie.
Usunąć pożywkę zubożoną w składniki odżywcze; ponownie zawiesić EB w świeżej pożywce i przenieść je do naczynia hodowlanego.
Inkubuj kulturę zawiesiny, aby ułatwić wzrost EB.
Przenieść EB zawieszone w podłożu na płytkę wielodołkową. Studzienki są pokryte białkiem adhezyjnym, co umożliwia przyczepianie się EB.
Wprowadź kwas retinowy, który dostaje się do komórek i wyzwala tworzenie kompleksu transkrypcyjnego.
Kompleks indukuje ekspresję genów, promując różnicowanie komórek w nerwowe komórki progenitorowe lub NPC, które wykazują rozszerzone procesy komórkowe.
Dodaj 1,5 miliona embrionalnych komórek macierzystych myszy do nieprzywierającej pożywki bakteryjnej w 10 mililitrach podstawowej pożywki różnicowej i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić utworzenie ciała zarodka.
Po dwóch dniach przenieś agregaty komórkowe do 15-mililitrowych probówek wirówkowych i pozwól im osiąść grawitacyjnie. Usunąć supernatant i dodać 10 mililitrów świeżej pożywki do różnicowania podstawowego w celu ponownego zawieszenia ciał zarodków. Następnie przesadź je z powrotem do nowego nieprzywierającego naczynia i inkubuj przez kolejne dwa dni.
Zebrać i wysiać około 50 ciał zarodków w 2 mililitrach podłoża do różnicowania podstawowego na studzienkę na płytkę sześciodołkową pokrytą żelatyną. W celu indukcji kwasu retinowego dodaj 2 mikrolitry bulionu RHA do każdej studzienki do końcowego stężenia 1 mikromola. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze i różnicuj komórki przez kolejne cztery dni.