Zmodyfikowana metoda rolkowa do długotrwałej hodowli wycinków mózgu gryzoni

Weźmy wycinki mózgu uzyskane z mózgu gryzonia. Plastry składają się z hipokampa, który zawiera neurony hipokampa.

Przenieś wycinki mózgu na szkiełka nakrywkowe zawierające osocze kurczaka.

Nałóż osocze zmieszane z trombiną na plastry. Trombina indukuje koagulację osocza, tworząc biologiczne rusztowanie, które sprzyja przyleganiu plastrów do szkiełek nakrywkowych.

Weź płaskie rurki rolkowe z otworem po płaskiej stronie i krążkiem samoprzylepnym przymocowanym wokół otworu na zewnątrz rurek.

Umieść szkiełka nakrywkowe na krążkach samoprzylepnych, upewniając się, że plastry mózgu są skierowane do wnętrza rurek.

Dodaj pożywkę do hodowli neuronów do probówek i przepływaj w mieszaninie dwutlenku węgla i powietrza.

Zakryj probówki, włóż je do stojaka na rolki i inkubuj je ruchem tocznym.

Napowietrzanie zapewniane przez inkubację toczną i składniki odżywcze pożywki wspierają długotrwałą hodowlę wycinków mózgu.

Na początek przygotuj stojak na rury rolkowe i wykonaj przyrząd, który pomoże w wywierceniu otworu w rurach rolkowych, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Za pomocą przyrządu przytrzymaj płaską 1-centymetrową plastikową rurkę hodowlaną tak, aby płaska strona była skierowana do góry. Następnie wywierć otwór o średnicy 6 milimetrów ze środkiem 1 centymetr od dołu i wyśrodkowanym między bokami rury.

Za pomocą obrotowego narzędzia do gratowania wygładź krawędzie otworu i wykonaj cztery rowki na wewnętrznej krawędzi otworu, aby ułatwić opróżnianie otworu podczas obracania. Następnie przepłucz probówki 70% etanolem, a następnie wysusz je na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Sterylizuj probówki w 12-milimetrowych dziurkowanych samoprzylepnych krążkach z gumy silikonowej przez 40 minut pod lampą UV.

Po 20 minutach zmień położenie probówek i krążków, aby wszystkie odsłonięte powierzchnie zostały wysterylizowane. Następnie odklej biały podkład z krążka samoprzylepnego. Dopasuj otwory i przymocuj gumę silikonową na zewnątrz rurki.

Po uzyskaniu plastrów umieść 2 mikrolitry osocza kurczaka na środku blaszki fototrawionej przygotowanego szkiełka nakrywkowego. Lekko rozprowadź plazmę, aby uzyskać plamkę o średnicy od 3 do 4 milimetrów. Następnie użyj sterylnej szpatułki z wąską końcówką, aby podnieść przygotowany plasterek mózgu. Użyj zamkniętych kleszczy, aby utrzymać plasterek na końcówce szpatułki podczas podnoszenia plasterka. Przyłóż szpatułkę do plamki plazmy na szkiełku nakrywkowym i przy zamkniętych kleszkach dociśnij plasterek do szkiełka nakrywkowego.

Dodaj cienką warstwę osocza pisklęcego na szkiełko nakrywkowe przed umieszczeniem plastra i minimalną ilość osocza poddanego działaniu trombiny, aby przykryć plasterek. Jeśli plasterek unosi się na wodzie, nie pozostanie przyklejony po usunięciu skrzepu.

Następnie wymieszaj 2,5 mikrolitra osocza i 2,5 mikrolitra trombiny w osobnej probówce. Szybko umieść 2,5 mikrolitra tej mieszaniny nad plasterkiem i wokół niego i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby go wymieszać. Usuń przezroczystą plastikową osłonę z odsłoniętej strony kleju z kauczuku silikonowego uprzednio przymocowanego do rury rolki. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe z plasterkiem mózgu na kleju, wyrównując plasterek w otworze.

Aby zapewnić przyczepność, należy delikatnie i równomiernie docisnąć szkiełko nakrywkowe kciukiem, równomiernie dociskając szkiełko nakrywkowe i przytrzymując je przez około 1 minutę podczas przenoszenia do szafy bezpieczeństwa biologicznego.

Nacisk na szkiełko nakrywkowe, aby przykleić się do rurki bez przeciekania, musi być odpowiedni i utrzymywany wystarczająco długo, aby wyeliminować kanały powietrzne w szczeliwie. Zbyt duży nacisk spowoduje pęknięcie szkiełka nakrywkowego.

W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 0,8 mililitra kompletnej pożywki do hodowli neuropodstawowej A do każdej probówki. Następnie przepuść mieszaninę 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza przez sterylną, zatkaną bawełną pipetę pastwiskową, bezpiecznie przytrzymywaną przez zacisk. Użyj tego, aby przepłukać rurkę rolkową mieszaniną gazów i szybko zakryć rurkę, gdy jest wyjmowana z okolic pipety.

Następnie oznacz tuby numerem plastra i numerem stojaka. Włóż rurki do stojaka na rolki, upewniając się, że są geometrycznie wyważone. Jeśli liczba probówek jest nieparzysta, dodaj puste rurki, aby zrównoważyć.

Umieść stojaki w inkubatorze rolkowym o temperaturze 35 stopni Celsjusza z rolkami obracającymi stojak rolkowy, aby utrzymać medium na dnie probówek. Przechyl inkubator do tyłu o około 5 stopni, podnosząc jego przód na deskę.