Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

Weźmy ludzką tkankę glejaka, pierwotny guz mózgu pochodzący z komórek glejowych.

Umyj tkankę za pomocą lodowatego podłoża do obróbki, aby usunąć resztki krwi.

Pokrój tkankę na kawałki i włóż ją do formy do zatapiania zawierającej stopioną agarozę.

Schłodź formę, pozwalając agarozie na polimeryzację i utworzenie stabilnej matrycy żelowej.

Wyjmij blok tkanki z formy i przymocuj go do płytki próbki wibratomu.

Dodaj lodowato zimne podłoże do obróbki, aby zanurzyć blok. Przepuścić utlenioną mieszaninę gazów, aby napowietrzyć pożywkę, utrzymując żywotność tkanek.

Przekrój osadzoną tkankę nowotworową na cienkie plasterki.

Przenieś plasterek na szalkę Petriego zawierającą lodowato pożywkę do obróbki, aby zachować architekturę tkanki.

Następnie umieść plasterek tkanki na przepuszczalnej wkładce membranowej w studzience zawierającej pożywkę do konserwacji kultur w plasterkach.

Utrzymuj plasterek w warunkach fizjologicznych. Kultura plastrów jest gotowa do dalszych testów.

Zacznij od użycia sterylnych kleszczy, aby umieścić puste wkładki hodowlane PTFE w każdym dołku sześciodołkowej płytki zawierającej 1 mililitr pożywki do konserwacji kultur w plasterkach na studzienkę. Po dodaniu wszystkich wkładek umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych z płaszczem wodnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO₂ .

Następnie umieść kawałki tkanki nowotworowej na szalce Petriego zawierającej lodowatą pożywkę do przetwarzania i za pomocą pipety delikatnie umyj tkankę trzy razy świeżą pożywką, aby usunąć wszelkie przylegające czerwone krwinki. Po trzecim praniu za pomocą skalpela pokrój kawałki guza na paski o wymiarach około 3 na 3 na 10 milimetrów, ostrożnie usuwając wszelkie przyczepione naczynia i unikając martwiczej lub kauteryzowanej tkanki.

Kiedy cała tkanka zostanie przycięta, dodaj 5 do 7 mililitrów płynnej agarozy o temperaturze 37 stopni Celsjusza do plastikowej formy do zatapiania o grubości 2 centymetrów sześciennych i schładzaj agarozę na lodzie przez minutę. Umieść 2 do 4 pasków tkanki w agarozie, z długą osią skierowaną pionowo, pozostawiając tkanki na lodzie na kolejne 2 do 5 minut po ich umieszczeniu.

Gdy agaroza zastygnie, odetnij boki formy skalpelem, aby delikatnie usunąć agarozę z formy i użyj obfitej kropli kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować blok agarozy do płytki próbki wibratomu.

Gdy klej stwardnieje, zanurz blok agarozy w lodowatym podłożu i użyj przyciętej, sterylnej plastikowej pipety, aby wprowadzić bąbelki mieszaniny 5% CO₂ 95% O₂ do pożywki w zbiorniku wibratomu. Ustaw grubość plastra wibratomu na 300 do 350 mikronów i dostosuj zaawansowaną prędkość ostrza i amplitudę ostrza zgodnie ze specyfikacją konsystencji tkanki i wibratomem.

Uzyskać odpowiednią liczbę wycinków zgodnie z planowaną analizą eksperymentalną. Za pomocą mikroszpatułki ze stali nierdzewnej przenieś plastry na szalkę Petriego zawierającą lodowato zimne podłoże w miarę ich pozyskiwania. Po pobraniu wszystkich plastrów użyj mikroszpatułki, aby przenieść każdą z nich na pojedynczą wkładkę PTFE.

Po 12-24-godzinnej inkubacji należy przez 15 minut utrzymywać nową sześciodołkową płytkę zawierającą świeżą pożywkę do utrzymywania kultur w plastrach. Następnie za pomocą sterylnych kleszczyków chwyć każdą wkładkę za krawędź i przenieś wkładki do indywidualnych dołków nowej sześciodołkowej płytki.