JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:02 min • July 8th, 2025
Zacznij od glejaków, agregatów komórkowych pochodzących z guza mózgu lub glejaka.
Dodaj enzymy dysocjacyjne. Inkubować w celu oddzielenia komórek glejaka i uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
Następnie wprowadź pożywkę hodowlaną wzbogaconą surowicą, aby zatrzymać aktywność enzymu.
Odwirować i usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki.
Przefiltrować zawiesinę, następnie odwirować i usunąć supernatant.
Ponownie zawieś komórki w prekursorach hydrożelu, które zawierają małe peptydy.
Załaduj tę mieszaninę do studzienek za pomocą wstępnie zmontowanej formy silikonowej zawierającej kwas hialuronowy.
Wymieszaj roztwór. Inkubuj, aby umożliwić interakcję między kwasem hialuronowym a prekursorami hydrożelu, tworząc hydrożel, który ułatwia uwięzienie komórek.
Pokryj hydrożel pożywką hodowlaną, aby utrzymać przeżycie komórek.
Po zdemontowaniu formy inkubuj hydrożel.
W hydrożelu białka adhezyjne na komórkach oddziałują z peptydami prekursorowymi i kwasem hialuronowym.
Powoduje to, że komórki tworzą małe skupiska i rozwijają trójwymiarową kulturę.
Na początek umieść czyste, suche formy z gumy silikonowej w każdym dołku 12-dołkowej płytki niepoddanej hodowli tkankowej i użyj czystego, końca końcówki pipety, aby przykleić foremki do dna płytki. Po sprawdzeniu uszczelnienia między formami a dnem studzienki, zbierz zdysocjowane kulki glejaka z hodowli komórek glejaka przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze enzymu dysocjacji komórek.
Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej wymieszać probówkę z delikatnym stukaniem i zatrzymać reakcję enzymatyczną czterema mililitrami kompletnego podłoża. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżej, kompletnej pożywki przed przecedzeniem komórek przez filtr o średnicy 70 mikrometrów. Przemyć sitko dodatkowymi czterema mililitrami kompletnego podłoża i podzielić zawiesinę na dwie porcje po 8 x 104 komórki na probówkę wirówkową.
Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić jedną osadkę w 80 mikrolitrach świeżo przygotowanego maleimidu glikolu polietylenowego lub PEG-Mal-RGD i jedną osadkę w 80 mikrolitrach świeżo przygotowanego roztworu PEG-Mal-CYS na formę. Używając końcówki do mikropipet o pojemności 200 mikrolitrów i szerokim otworze, dodaj 40 mikrolitrów roztworu kwasu hialuronowego do każdej formy gumowo-silikonowej, a następnie 40 mikrolitrów roztworu ogniw PEG-Mal-CYS lub PEG-Mal-RGD, szybko pipetując w górę iw dół nie więcej niż 10 razy na formę w celu wymieszania.
Ze względu na szybki czas żelowania, po wymieszaniu dwóch składników hydrożelu, ważne jest, aby użyć końcówki pipety o szerokim otworze, aby szybko, ale dokładnie wymieszać roztwory. Ten krok wymaga praktyki.
Następnie umieść komórki w kapsułkach żelowych w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na 5 do 10 minut. Pod koniec inkubacji dodaj od 2 do 2,5 mililitra pożywki hodowlanej do każdego żelu i użyj sterylnej, dwumikrolitrowej końcówki pipety i kleszczyków, aby delikatnie oddzielić żele od boków form. Następnie za pomocą wysterylizowanych kleszczy usuń pleśnie z dołków płytkowych i włóż płytkę z powrotem do inkubatora komórkowego.