Hydrożel na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka

Zacznij od glejaków, agregatów komórkowych pochodzących z guza mózgu lub glejaka.

Dodaj enzymy dysocjacyjne. Inkubować w celu oddzielenia komórek glejaka i uzyskać zawiesinę jednokomórkową.

Następnie wprowadź pożywkę hodowlaną wzbogaconą surowicą, aby zatrzymać aktywność enzymu.

Odwirować i usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki.

Przefiltrować zawiesinę, następnie odwirować i usunąć supernatant.

Ponownie zawieś komórki w prekursorach hydrożelu, które zawierają małe peptydy.

Załaduj tę mieszaninę do studzienek za pomocą wstępnie zmontowanej formy silikonowej zawierającej kwas hialuronowy.

Wymieszaj roztwór. Inkubuj, aby umożliwić interakcję między kwasem hialuronowym a prekursorami hydrożelu, tworząc hydrożel, który ułatwia uwięzienie komórek.

Pokryj hydrożel pożywką hodowlaną, aby utrzymać przeżycie komórek.

Po zdemontowaniu formy inkubuj hydrożel.

W hydrożelu białka adhezyjne na komórkach oddziałują z peptydami prekursorowymi i kwasem hialuronowym.

Powoduje to, że komórki tworzą małe skupiska i rozwijają trójwymiarową kulturę.

Na początek umieść czyste, suche formy z gumy silikonowej w każdym dołku 12-dołkowej płytki niepoddanej hodowli tkankowej i użyj czystego, końca końcówki pipety, aby przykleić foremki do dna płytki. Po sprawdzeniu uszczelnienia między formami a dnem studzienki, zbierz zdysocjowane kulki glejaka z hodowli komórek glejaka przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze enzymu dysocjacji komórek.

Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej wymieszać probówkę z delikatnym stukaniem i zatrzymać reakcję enzymatyczną czterema mililitrami kompletnego podłoża. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżej, kompletnej pożywki przed przecedzeniem komórek przez filtr o średnicy 70 mikrometrów. Przemyć sitko dodatkowymi czterema mililitrami kompletnego podłoża i podzielić zawiesinę na dwie porcje po 8 x 10⁴ komórki na probówkę wirówkową.

Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić jedną osadkę w 80 mikrolitrach świeżo przygotowanego maleimidu glikolu polietylenowego lub PEG-Mal-RGD i jedną osadkę w 80 mikrolitrach świeżo przygotowanego roztworu PEG-Mal-CYS na formę. Używając końcówki do mikropipet o pojemności 200 mikrolitrów i szerokim otworze, dodaj 40 mikrolitrów roztworu kwasu hialuronowego do każdej formy gumowo-silikonowej, a następnie 40 mikrolitrów roztworu ogniw PEG-Mal-CYS lub PEG-Mal-RGD, szybko pipetując w górę iw dół nie więcej niż 10 razy na formę w celu wymieszania.

Ze względu na szybki czas żelowania, po wymieszaniu dwóch składników hydrożelu, ważne jest, aby użyć końcówki pipety o szerokim otworze, aby szybko, ale dokładnie wymieszać roztwory. Ten krok wymaga praktyki.

Następnie umieść komórki w kapsułkach żelowych w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO₂ na 5 do 10 minut. Pod koniec inkubacji dodaj od 2 do 2,5 mililitra pożywki hodowlanej do każdego żelu i użyj sterylnej, dwumikrolitrowej końcówki pipety i kleszczyków, aby delikatnie oddzielić żele od boków form. Następnie za pomocą wysterylizowanych kleszczy usuń pleśnie z dołków płytkowych i włóż płytkę z powrotem do inkubatora komórkowego.