JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 5:12 min • July 8th, 2025
Zacznij od mózgu szczeniaka myszy.
Wyizoluj móżdżek i uzyskaj plastry tkanki o odpowiedniej grubości.
Przenieść plastry na wkładki membranowe umieszczone w dołkach na płytki hodowlane zawierające pożywkę.
W studzienkach poddanych działaniu substancji pożywka zawiera neuroprotekcyjny związek testowy. W studniach kontrolnych brakuje tego związku. Inkubować.
W warunkach kontrolnych komórki Purkinjego móżdżku ulegają apoptozie, naśladując wczesny rozwój pourodzeniowy in vivo.
W studzienkach poddanych zabiegowi, w zależności od swojego potencjału, związek może chronić komórki przed apoptozą.
Umyj plastry i przymocuj je, aby zachować integralność komórkową.
Przenieś plastry do roztworu blokującego przepuszczalność, aby przepuszczalnie błony komórkowe i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.
Nakładka z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko białku wiążącemu wapń specyficznie eksprymowanemu w komórkach Purkinjego.
Przemyć i wprowadzić przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem skierowane przeciwko przeciwciałom pierwszorzędowym.
Wybarwić jądra barwnikiem wiążącym DNA i zamontować plastry.
Za pomocą mikroskopu konfokalnego określ ilościowo żywotne komórki Purkinjego, aby zidentyfikować potencjał neuroprotekcyjny badanego związku
Aby zebrać móżdżek, użyj prostych kleszczy opatrunkowych, aby chwycić głowę szczeniaka za nos i użyj prostych nożyczek do oczu, aby rozciąć skórę głowy od tylnego końca bocznie do linii środkowej. Rozetnij czaszkę w ten sam sposób, kierując końcówki nożyczek na zewnątrz, aby uniknąć uszkodzenia móżdżku, i użyj szpatułki, aby przenieść mózg do 60-milimetrowego naczynia zawierającego zimny HBSS i 5 miligramów na mililitr glukozy.
Użyj prostych kleszczy opatrunkowych, aby ostrożnie wypreparować móżdżek i użyj sterylnych, zakrzywionych cienkich kleszczyków, aby umieścić tkankę na plastikowym krążku na stole do cięcia siekacza do tkanek. Obróć stół do cięcia, aby zorientować tkankę, aby umożliwić uzyskanie odcinków przystrzałkowych, i pociągnij pokrętło zwalniające stół w prawo, aby przesunąć stół do cięcia, aż ostrze znajdzie się na krawędzi tkanki. Następnie dostosuj grubość plastra do 350 mikrometrów, a prędkość ostrza na średnią i uruchom rozdrabniacz. Gdy cały móżdżek zostanie pokrojony, wyłącz siekacz.
Za pomocą sterylnych kleszczyków przytrzymaj dysk nad nowym 60-milimetrowym naczyniem. Użyj pipety transferowej, aby przepłukać HBSS i glukozę przez dysk, tak aby plastry wpadły do naczynia. Następnie, dotykając próbek tak minimalnie, jak to możliwe, użyj mikrosondy, aby oddzielić plasterki.
Użyj pipety transferowej, aby wybrać sekcje móżdżku w pobliżu robaka na poszczególne wkładki do hodowli komórkowych na płytce sześciodołkowej i użyj mikrosondy, aby umieścić plastry w środku każdej wkładki. Po umieszczeniu wszystkich plastrów ostrożnie odessać nadmiar HBSS wraz z glukozą i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.
W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego należy usunąć supernatant z każdej studzienki i umyć wkładki PBS. Przymocuj plastry 1 mililitrem zimnego 4% paraformaldehydu w dołku każdej wkładki i 500 mikrolitrami na wierzchu każdej wkładki przez 1 godzinę.
Pod koniec utrwalania umyj wkładki cztery razy przez 10 minut z 1 mililitrem świeżego PBS pod każdą wkładką i 500 mikrolitrami świeżego PBS na wierzchu każdej wkładki na mycie na wytrząsarce orbitalnej. Wstępnie napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 500 mikrolitrami PBS-TB i za pomocą pędzla przenieś plastry móżdżku z każdej wkładki do hodowli komórkowej do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki.
Przepuszczalność i zablokowanie plastrów w temperaturze pokojowej na godzinę. Pod koniec inkubacji oznacz komórki 200 mikrolitrami pierwszorzędowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, rozcieńczonego w PBS-TB na studzienkę przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej.
Następnego ranka umyj plastry cztery razy przez 10 minut i 500 mikrolitrów świeżego PBS na pranie na wytrząsarce, a następnie oznacz próbki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce chronionej przed światłem.
Pod koniec inkubacji należy wybarwić skrawki 500 mikrolitrami odpowiedniego barwnika jądrowego na studzienkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem i użyć pipety transferowej do zamontowania plastrów na szkiełkach podstawowych.
Następnie pozwól skrawkom całkowicie wyschnąć na powietrzu przed ponownym nawodnieniem za pomocą PBS i przymocowaniem tkanek za pomocą szkiełek nakrywkowych pokrytych około 80 mikrolitrami podłoża montażowego. Po utwardzeniu podłoża montażowego odcinki móżdżku są gotowe do obrazowania.