JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:35 min • July 8th, 2025
Zacznij od próbek tkanki hipokampa zawierającej neurony i różne komórki nieneuronalne.
Dodaj roztwór enzymu proteazy. Enzym degraduje macierz zewnątrzkomórkową tkanki, inicjując dysocjację komórki.
Umyć środkiem galwanicznym w celu usunięcia pozostałości enzymów.
Kilkakrotnie pipetować strawioną tkankę, aby mechanicznie oddzielić komórki od tkanki, tworząc zawiesinę jednokomórkową.
Odwirować i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w podłożu galwanicznym.
Wysiewać komórki na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną na płytce wielodołkowej. Lizyna zwiększa przyczepianie komórek.
Zastąp pożywkę posiewową pożywką podtrzymującą neurony, zawierającą składniki odżywcze niezbędne do przetrwania neuronów.
Odśwież połowę pożywki za pomocą pożywki konserwacyjnej zawierającej arabinozylocytozynę lub Ara-C.
Ara-C wnika do komórek i selektywnie hamuje wzrost komórek nieneuronalnych, prowadząc do ich śmierci.
Zastąp pożywkę nową pożywką podtrzymującą, aby wspomóc przeżycie neuronów.
Aby oddzielić neurony hipokampa do hodowli, rozmrozić roztwór enzymu proteazy i wstępnie podgrzać podłoże galwaniczne w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie spłucz wypreparowany hipokamp za pomocą SLDS. Następnie usuń go i dodaj 2 mililitry roztworu enzymu proteazy i inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Następnie umyj eksplantaty hipokampa dwukrotnie 5 do 10 mililitrami podłoża galwanicznego i dodaj 5 mililitrów podłoża galwanicznego. Oddziel eksplantaty hipokampa na pojedyncze komórki, generując mały wir za pomocą pipety z 1-mililitrową plastikową końcówką. Pipetować w górę i w dół około 40 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków tlenu, aż roztwór stanie się mętny i nie pozostaną żadne duże kawałki eksplantatu.
Następnie odwiruj komórki pod ciśnieniem 1,125 razy większym od grawitacji przez 3 minuty. Usunąć supernatant z komórkami zanurzonymi w pożywce i ponownie zawiesić komórki w 145 mililitrach pożywki galwanicznej. Następnie dodaj 1 mililitr zawiesiny komórek na studzienkę do płytki 24-dołkowej. Inkubować komórki w pożywce galwanicznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin.
Następnie usuń podłoże galwaniczne i zastąp je świeżym medium konserwacyjnym. Po dwóch dniach zastąp połowę pożywki dwoma mikromolowymi Ara-C rozpuszczonymi w pożywce podtrzymującej, aby zahamować wzrost fibroblastów, śródbłonka i komórek glejowych. Następnie, po wystawieniu komórek na działanie Ara-C przez dwa dni, zastąp pożywkę świeżą pożywką konserwacyjną.
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje proces dysocjacji neuronów hipokampa z próbek tkankowych w celu ich hodowli. Przedstawia on kolejne etapy przygotowania komórek do utrzymania i wzrostu in vitro.
Niezawodna dysocjacja i hodowla neuronów hipokampa umożliwiają tworzenie standaryzowanych, wzbogaconych w neurony systemów in vitro do wczesnych etapów poszukiwania leków w neuronauce. Hodowle te stanowią kontrolowaną platformę do badania mechanizmów neuronalnych, co zwiększa wiarygodność przewidywań w walidacji celów terapeutycznych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego. Selektywność tej metody w odniesieniu do populacji neuronalnych zwiększa ciągłość translacyjną i usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio w procesach badawczo-rozwojowych skoncentrowanych na neurobiologii.
Niniejszy protokół dysocjacji i hodowli neuronów znajduje zastosowanie na styku wczesnych etapów odkryć i rozwoju testów, zapewniając podstawowe systemy do późniejszego screeningu oraz badań mechanistycznych.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026