Technika generowania monowarstwy 2D komórek móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Zacznij od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kolonii komórek macierzystych hodowanych na przylegającej macierzy błony podstawnej.

Dodaj pożywkę różnicującą móżdżek zawierającą określony hormon, czynnik wzrostu i inhibitory małych cząsteczek.

Podnieś kolonie za pomocą szklanej pipety i przenieś je na bardzo niską płytkę mocującą.

Powierzchnia o niskim przyleganiu utrzymuje komórki w zawiesinie, ułatwiając ich agregację w trójwymiarowe ciała zarodkowe lub EB.

Hormon, czynnik wzrostu i inhibitory wiążą się ze swoimi odpowiednimi miejscami docelowymi, promując różnicowanie komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe.

Przenieś EB do dołków na płytkach hodowlanych pokrytych syntetycznym polimerem i białkiem adhezyjnym, aby ułatwić przyczepienie EB.

Zastąp pożywkę pożywką wolną od inhibitorów.

Komórki zaczynają migrować na zewnątrz od EB, tworząc monowarstwę 2D.

Usuń pożywkę i dodaj pożywkę do dojrzewania móżdżku.

Czynniki wzrostu w pożywce indukują dojrzewanie neuronalnych komórek progenitorowych do odrębnych prekursorów neuronów móżdżku.

W dniu zerowym dodaj 1 mililitr pożywki różnicującej móżdżek uzupełnionej 10 mikromolami Y27632 i SB431542 do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o bardzo niskim nasadce lub ULA i umieść ją w inkubatorze, aż podniesione kolonie będą gotowe do dodania do studzienek. Oczyść zróżnicowane komórki za pomocą wyciągniętej szklanej pipety. Odessać pożywkę i dodać 1 mililitr roztworu pasażacyjnego iPSC na każde 35-milimetrowe naczynie.

Po trzech minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza odessać pożywkę i dodać 2 mililitry pożywki różnicującej móżdżek uzupełnionej 10 mikromolowym Y27632 i SB431542. Pod 4-krotnym powiększeniem mikroskopu odwróconego w świetle przechodzącym podnieś kolonie za pomocą wygiętej krawędzi wyciągniętej szklanej pipety. Po podniesieniu każdej kolonii delikatnie przenieś wszystkie kolonie do jednego dołka 6-dołkowej płytki ULA za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej. Powtórz ten proces dla każdej płytki iPSC i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

W dniu 2 dodaj FGF2 do każdej studzienki, aby dostosować końcowe stężenie 50 nanogramów na mililitr. W dniu 7 zmień jedną trzecią pożywki, odsysając 1 mililitr zużytej pożywki i zastępując ją 1 mililitrem świeżej pożywki różnicującej móżdżek. Inkubować ciała zarodków przez siedem dni.

W dniu 14 zakręć płytką, aby zebrać wszystkie ciała zarodków w środku płytki. Następnie przechyl płytkę i odessaj całe zużyte podłoże za pomocą pipetora o pojemności 1000 mikrolitrów od krawędzi. W miarę zmniejszania się ilości pożywki, powoli układaj płytkę płasko i kontynuuj aspirację, pozostawiając wystarczającą ilość pożywki, aby uniknąć wysuszenia ciał zarodków.

Następnie dodaj 3 mililitry świeżej pożywki do różnicowania móżdżku uzupełnionej 10 mikromolami. Y27632. Następnie przenieś ciała zarodkowe za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej do naczynia pokrytego poli-L-Ornityną pokrytą laminą. W 15 dniu odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką różnicującą móżdżek.