Hodowla i utrzymanie neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy

Traktuj embrionalną tkankę śródmózgowia, bogatą w rozwijające się neurony dopaminergiczne, roztworem trypsyny-EDTA, aby odłączyć je od macierzy tkankowej.

Dodaj pożywkę dezaktywującą, aby zahamować aktywność enzymów, a następnie umyj, aby usunąć pozostałości enzymów.

Kilkakrotnie pipetować tkankę. Neurony embrionalne mają mniej projekcji, co zmniejsza stres podczas tego zaburzenia i generuje zawiesinę pojedynczej komórki.

Odwirować i usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić neurony w kompletnym pożywce. Przenieś te neurony na pokryte polimerem szkiełko nakrywkowe w celu przyłączenia komórek.

Umieść szkiełko nakrywkowe na płytce wielodołkowej z kompletnym podłożem, dostarczającym składników odżywczych i czynników wzrostu niezbędnych do wzrostu neuronów.

Antybiotyki zawarte w pożywce zapobiegają rozwojowi bakterii, wspierając żywotność neuronów.

W miarę wzrostu i dojrzewania neurony rozwijają projekcje komórkowe, takie jak aksony i dendryty, tworząc połączenia synaptyczne.

Okresowo usuwaj połowę zużytych pożywek, aby wyeliminować toksyczne produkty uboczne.

Dodaj świeżą pożywkę do długotrwałego utrzymania neuronów dopaminergicznych.

Pod maską wyjmij HBSS z kolekcji brzusznego śródmózgowia. Następnie dodaj mililitr ciepłego 0,05% trypsyny-EDTA, roztworu wystarczającego na 12 kawałków tkanki. Inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 do 10 minut. Pod maską zastąp trypsynę-EDTA 1 mililitrem pożywki dezaktywującej.

Delikatnie zamieszaj mieszankę, a następnie usuń pożywkę dezaktywującą, ale pozostaw wystarczającą ilość pożywki, aby zdysocjowane komórki nie zostały wyrzucone. Następnie dwukrotnie umyj chusteczki kompletnym podłożem, nie tracąc komórek. Teraz dodaj 1 mililitr kompletnego podłoża. Następnie rozcierać tkankę wypolerowaną ogniowo pipetą, nie tworząc pęcherzyków, aż do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Około 8 do 10 przejść powinno wystarczyć.

Po roztarciu odwirować komórki o masie 400 g przez 5 minut. Usuń pożywkę i ponownie zawieś komórki w 1 mililitrze kompletnego podłoża. Odpipetować komórki do 4 razy, aby uzyskać zawiesinę. Rozpocznij od policzenia i oceny stanu zdrowia komórek w zawiesinie za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.

Teraz dostosuj zawiesinę komórek do 1,500 komórek na mikrolitr. Następnie przenieś wysterylizowane nakrętki probówek mikrowirówkowych do 100-milimetrowych naczyń. Przygotowane szkiełka nakrywkowe nakładać na nakrętki za pomocą kleszczy. Nie myj szkiełek nakrywkowych i staraj się nie dopuścić do ich wyschnięcia. Załaduj 100 mikrolitrów zawiesiny na każde szkiełko nakrywkowe.

Ta nieco nietypowa metoda zapewnia 90% żywotności kultury i jest kluczowym krokiem do sukcesu. Następnie zamknij szalkę Petriego i przenieś ją do inkubatora na godzinę. Po inkubacji ostrożnie przenieść szkiełka nakrywkowe z pożywką na płytki 24-dołkowe, zawierające 400 mikrolitrów kompletnego podłoża ogrzanego do 37 stopni Celsjusza w każdym dołku. Następnie inkubuj komórki przez noc.

Pierwsze godziny są najbardziej krytyczne dla przeżycia komórki. W ciągu 24 godzin delikatnie dodaj pół mililitra kompletnego podłoża do każdej studzienki. Co 2 tygodnie zmieniaj połowę nośnika. Jeśli kultura zmieni kolor na żółty, zmianę pożywki można przeprowadzić wcześniej, ale zmiana powinna być nadal rzadka. Neurony dopaminergiczne przetrwają w tych warunkach dłużej niż 6 tygodni.