Izolowanie i hodowla mysich progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku

Weźmy mysie szczenię cerebella.

Zhomogenizuj je na mniejsze fragmenty.

Dodaj enzym proteolityczny do trawienia macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki, rozluźniając ziarniste komórki progenitorowe móżdżku lub CGNP i astrocyty.

Dodać pożywkę hodowlaną CGNP zawierającą surowicę, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną. Odwirować i wyrzucić supernatant bogaty w enzymy.

Ponownie zawiesić fragmenty tkanek w pożywce CGNP. Mechanicznie dysocjuj tkankę, aby uwolnić komórki.

Gdy szczątki opadną, przenieś supernatant zawierający komórki do nowej probówki.

Odwirować i usunąć supernatant z zanieczyszczeniami.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce CGNP i zasiać je w wielodołkowych dołkach płytkowych pokrytych poli-D-lizyną. Inkubować.

Astrocyty osiadają i silnie przylegają do powłoki poli-D-lizyny w porównaniu z CGNP.

Wstrząsnąć płytką i zebrać supernatant zawierający CGNP. Odwirować i usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić CGNP w pożywce CGNP i umieścić je na płytce wielodołkowej pokrytej poli-L-ornityną. Inkubować.

CGNP przyczepiają się do powlekanej powierzchni i namnażają się, wspomagane przez składniki mediów i poli-L-ornitynę.

Przenieś trzy do pięciu móżdżku do 15-mililitrowych rurek. Umyj móżdżek glukozą HBSS przed odwirowaniem. Odwirować probówki, aby zebrać tkankę. Po ostatnim płukaniu homogenizuj móżdżek, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy za pomocą 1-mililitrowej pipety, aż fragmenty osiągną wielkość od 0,5 do 1 milimetra sześciennego.

Delikatnie usuń cały płyn, aż pozostanie 2,5 mililitra. Następnie dodaj 0,05% trypsyny do probówki z glukozą HBSS zawierającą móżdżkę i inkubuj tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Odwróć tkankę co 1 do 3 minut. Po inkubacji zatrzymaj trawienie, dodając 5 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych cGMP lub CGM i zbierz tkankę przez odwirowanie, jak poprzednio.

Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać 1 mililitr CGM. Rozcieraj tkankę za pomocą 1-mililitrowej końcówki pipety, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj 5 mililitrów CGM i inkubuj mieszaninę przez dwie minuty na lodzie, aby osadzić resztki tkanek. Gdy tkanka się uspokoi, przenieś supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki. Następnie dodaj 2 mililitry CGM do pozostałej tkanki i powtórz procedurę rozcierania przed pobraniem supernatantu i odrzuceniem resztek tkanki.

Połącz supernatanty z każdej 15-mililitrowej probówki tkanki i odwiruj, aby zebrać komórki móżdżku. Zawiesić granulat w 10 mililitrach CGM. Ponieważ astrocyty szybciej i silniej przylegają do poli-D-lizyny niż cGMP, dodaj do 4 mililitrów zawiesiny komórkowej do studzienek 6-dołkowych płytek pokrytych poli-D-lizyną i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć astrocyty.

Potrząśnij talerzem. Zebrać supernatant do 15-mililitrowej probówki, a następnie odwirować supernatant jak poprzednio. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach CGM i policzyć komórki za pomocą komory liczącej Neubauera. Po 4 do 6 godzinach przylegające cGMP wydają się okrągłe i proliferują. Wysiewaj komórki w CGM na płytkach pokrytych poli-L-ornityną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO₂ i 100% wilgotności względnej.