JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:00 min • July 8th, 2025
Zacznij od kolonii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych lub hPSC przyłączonych do odpowiedniego podłoża w pożywce hodowlanej.
Usuń nośnik. Dodać pożywkę neuronalną zawierającą specyficzne inhibitory i inkubować.
Inhibitory te kierują dojrzewanie hPSC w kierunku linii neuronalnej, tworząc kolonie neuroektodermalne. Są one prekursorami małych, kulistych struktur zwanych sferoidami.
Usuń pożywkę i przemyj buforem soli.
Inkubuj z enzymem trawiennym, aby oderwać kolonie od płytki.
Dodaj pożywkę neuronalną, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.
Zbierz kolonie i przenieś je do probówki.
Pozwól im się uspokoić, a następnie wyrzuć supernatant.
Ponownie zawiesić kolonie w pożywce neuronalnej zawierającej czynnik wzrostu.
Przenieś kolonie na płytkę wielodołkową i inkubuj.
Ten czynnik wzrostu ułatwia samoorganizację i namnażanie się komórek neuroektodermalnych, prowadząc je do utworzenia sferoidy.
Na początek umieść kolonie hPSC na matrycy błony podstawnej zakwalifikowanej do hESC z jednej studzienki 6-dołkowej płytki przy 60% konfluencji do trzech dołków, aby osiągnąć gęstość od 20% do 30%, a następnie przystąp do indukcji kolonii neuroektodermalnych 2D.
Dodawaj świeże podłoże N2 uzupełnione podwójnymi inhibitorami SMAD codziennie do każdego dołka przez następne 3 dni. Aby wygenerować sferoidy neuroektodermalne 3D z indukowanych kolonii neuroektodermalnych 2D, usuń 2 mililitry pożywki N2 z płytki 6-dołkowej i przemyj jeden raz HBSS, aby upewnić się, że cała pożywka N2 została usunięta.
Dodaj 1 mililitr dypazy do każdej studzienki zawierającej kolonię. Inkubuj płytkę przez 20 do 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i regularnie sprawdzaj, czy kolonia nie została oderwana. Pod koniec inkubacji, aby zatrzymać aktywność enzymu dyspazy, dodaj 1 mililitr pożywki N2 do studzienki. Używając końcówki do pipety P1000 o szerokim otworze lub zmodyfikowanej końcówki do pipety P1000 ze sterylnymi nożyczkami, przenieś kolonie do 15-mililitrowej probówki i pozwól, aby grudki kolonii opadły na dno rurki pod wpływem grawitacji.
Następnie, za pomocą standardowej końcówki do pipet P1000, ostrożnie usuń supernatant. Zastąp go 1 mililitrem świeżego podłoża N2 i powtórz mycie trzy razy, aby zapewnić całkowite usunięcie dypazy. Po ponownym zawieszeniu grudek komórek i pożywki N2 przenieś zawiesinę komórek do jednego dołka 6-dołkowej płytki i dodaj 40 nanogramów na mililitr bFGF.