Technika izolowania komórek satelitarnych z tkanki mięśniowej głowy szczura

Zacznij od mięśnia głowy szczura i posiekaj go na fragmenty.

Dodaj koktajl enzymów proteolitycznych i inkubuj, delikatnie potrząsając.

Enzymy trawią macierz zewnątrzkomórkową tkanki, rozluźniając włókna mięśniowe.

Dodać pożywkę zawierającą białka surowicy, aby dezaktywować enzymy.

Przenieść tkankę do probówki, odwirować i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić tkankę w pożywce. Powtórz mechaniczne rozerwanie i odwirowanie dwukrotnie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek satelitarnych - komórek macierzystych kluczowych dla naprawy i regeneracji mięśni.

Zebrać supernatant zawierający komórkę satelitarną.

Przepuścić przez sitko do komórek, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Odwirować, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce.

Umieść krople zawiesiny komórkowej w studzienkach szkiełkowych pokrytych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej.

Powlekana powierzchnia ułatwia mocowanie ogniw satelitarnych. Dodaj pożywkę do studzienek.

Czynniki wzrostu w pożywce indukują proliferację i różnicowanie komórek satelitarnych w mioblasty - prekursory komórek mięśniowych, które dalej proliferują i łączą się, tworząc wielojądrowe miotuby.

Miorurki w końcu dojrzewają do włókien mięśniowych.

Aby wyizolować komórki satelitarne, przenieś każdy mięsień do indywidualnych dołków sześciodołkowej płytki i pokrój tkanki na małe 2-milimetrowe kawałki, uważając, aby nie zmielić zbytnio mięśni. Następnie ostrożnie inkubuj fragmenty tkanek w 2,5 mililitra 0,1% roztworu pronazy na studzienkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut, delikatnie wstrząsając, co 20 minut.

Gdy wiązki włókien wykażą rozluźniony wygląd, dodaj 2,5 mililitra DMEM, uzupełnionego surowicą końską i antybiotykami do każdej studzienki i przenieś strawione tkanki do pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek. Odwirować zawiesiny tkanek i zdekantować supernatanty. Następnie dodaj 5 mililitrów pożywki do każdej probówki i homogenizuj tkankę za pomocą 10-mililitrowej plastikowej pipety.

Ponownie odwiruj tkanki i przenieś supernatanty do nowych 15-mililitrowych stożkowych probówek. Następnie dodaj 5 dodatkowych mililitrów pożywki do probówek i ponownie rozcieraj kawałki tkanki, aż fragmenty łatwo przejdą przez pipetę.

Po kolejnym odwirowaniu zebrać supernatanty w odpowiednich probówkach i przefiltrować zawiesiny komórek przez sitka o długości 40 mikrometrów do pojedynczych probówek o pojemności 50 mililitrów. Umyj sitka 1 mililitrem DMEM, aby uzyskać maksymalny odzysk komórek. Następnie odwiruj komórki. Ponownie zawiesić granulki w świeżej pożywce i policzyć komórki.

Aby wyhodować izolowane komórki satelitarne, należy następnie rozcieńczyć zawiesiny komórek do 1,5 x 10³ komórek na 10 mikrolitrów pożywki hodowlanej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów komórek do każdego wcześniej przygotowanego miejsca żelu macierzy zewnątrzkomórkowej i inkubuj żele w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po sześciu godzinach ostrożnie dodaj 400 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdego miejsca żelu i włóż szkiełka z powrotem do inkubatora. Po trzech dniach zainicjuj różnicowanie komórek z dodatkiem odpowiedniej pożywki hodowlanej.