JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:02 min. • July 8th, 2025
Weźmy zawiesinę komórek raka embrionalnego myszy zdolną do różnicowania się w różne typy komórek.
Komórki nasienne na hydrofobowym naczyniu hodowlanym zawierającym pożywkę i kwas retinowy.
Inkubować. Powierzchnie hydrofobowe zapobiegają przyleganiu komórek, powodując tworzenie przez nie agregatów.
Kwas retinowy wnika do agregatów komórkowych, uruchamiając szlaki sygnałowe i powodując różnicowanie w neuronalne komórki progenitorowe.
Po inkubacji zebrać agregaty komórkowe.
Wyrzuć nośnik.
Dodaj pożywkę zawierającą kwas retinowy i wysiewaj agregaty na hydrofobowe naczynie hodowlane.
Inkubować. Kwas retinowy ułatwia trwałe różnicowanie komórkowe w neurony.
Zbierz agregaty i usuń nośniki.
Dodaj enzym proteolityczny, aby zakłócić adhezje komórka-komórka w agregatach.
Dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.
Mechanicznie dysocjują agregaty, tworząc zawiesinę neuronalną.
Odwirować i wyrzucić supernatant bogaty w enzymy.
Ponownie zawiesić neurony w pożywce i umieścić je na przylegającej płytce wielodołkowej zawierającej pożywkę.
Inkubować. Neurony przylegają do płytki i dojrzewają, wydłużając długie projekcje.
W celu wytworzenia agregatu należy rozpocząć od dodania 10 mililitrów pożywki różnicującej uzupełnionej 5 mikrolitrami RZS do 100-mililitrowej szalki hodowlanej niepoddanej działaniu środka. Wysiewaj 1 milion komórek w naczyniu hodowlanym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni, aby pobudzić tworzenie agregatów.
Po inkubacji, za pomocą 10-mililitrowej pipety, odessać pożywkę zawierającą agregaty i przenieść ją do 15-mililitrowej probówki o temperaturze pokojowej. Odczekaj 1,5 minuty, aż agregaty osiądą na dnie, a następnie wyrzuć supernatant.
Dodać 10 mililitrów świeżej pożywki różnicującej uzupełnionej 0,5 mikromolowym RA. Delikatnie wysadź agregaty w nowym, 100-milimetrowym, niepoddanym działaniu substancji naczyniu hodowlanym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni.
Na początek użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść agregaty komórek do 15-mililitrowej probówki. Odczekaj 1,5 minuty w temperaturze pokojowej, aż kruszywa osiądą na dnie, a następnie wyrzuć supernatant. Umyj agregaty surowicą i DMEM bez antybiotyków. Poczekaj, aż agregaty komórek osiądą na dnie. Odrzuć supernatant i dodaj 2 mililitry 0,25% trypsyny EDTA.
Inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, stukając co dwie minuty, aby utrzymać komórki w zawiesinie. Następnie dodaj 4 mililitry pożywki konserwacyjnej, aby zatrzymać aktywność trypsyny, i pipetuj w górę iw dół 20 razy za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra.
Na koniec odwiruj komórki w temperaturze 200 razy g i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 mililitrach pożywki konserwującej. Użyj licznika komórek, aby określić liczbę komórek i przystąp do powlekania komórek. Do komórek płytki najpierw dodaj 3 mililitry pożywki konserwacyjnej na studzienkę do sześciodołkowej płytki hodowlanej. Następnie zasiej komórki w gęstości 500 000 na dołek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.