Różnicowanie komórek ciała zarodka w progenitory nerwowe za pomocą kwasu retinowego

Zacznij od embrionalnych komórek macierzystych hodowanych na warstwie komórek odżywiających fibroblasty, które utrzymują komórki macierzyste w stanie niezróżnicowanym.

Dodaj trypsynę, enzymy i EDTA, aby zakłócić adhezję między komórkami i odłączyć komórki.

Później dodaj pożywkę hodowlaną wzbogaconą surowicą, aby zatrzymać aktywność enzymu i przenieś zawiesinę komórkową do probówki.

Odwirować w celu zebrania komórek, usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce zawierającej kwas retinowy.

Umieść kropelki tej zawiesiny komórkowej na dnie nieprzywierającej naczynia hodowlanego.

Odwróć podstawę, aby utworzyć wiszące krople i umieść ją nad pokrywką naczynia hodowlanego wypełnioną buforem, aby zapobiec wysychaniu kropel.

W wiszących kroplach grawitacja powoduje, że komórki osiadają na dnie, ostatecznie agregując się w trójwymiarowe struktury zwane ciałami embrionalnymi.

Ponadto komórki wchłaniają kwas retinowy, który moduluje różne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe.

Ta modulacja stymuluje różnicowanie komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe ze zdolnością do produkcji neuronów.

Rozpocznij tworzenie ciała zarodka od pobrania embrionalnych komórek macierzystych z 0,25% trypsyny-EDTA przez 2 do 5 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Dodaj świeżą pożywkę Iscove's Modified Dulbecco lub IMDM z 15% FBS do oddzielających komórek, a następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.

Wirować przy 160 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę 5 x 10⁵ komórek na mililitr w IMDM z 0,5 mikromolowym kwasem retinowym. Następnie użyj 8-kanałowej pipety i końcówek o pojemności 200 mikrolitrów, aby nanieść krople o pojemności 120 mikrolitrów na 100-mililitrową szalkę Petriego. Odwróć naczynie i napełnij odwróconą pokrywkę PBS, aby zapobiec wysychaniu wiszących kropli. Kultura w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 3 do 4 dni.