JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:27 min. • July 8th, 2025
Weź przylegające kultury pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów lub OPC w pożywce wzrostowej.
Dodaj kontrolne wektory lentiwirusowe do studzienki kontrolnej i wektory testowe, kodujące białka sygnałowe regulujące mielinizację, do dołka testowego, a następnie inkubuj.
Komórki internalizują wektory, a wirusowe RNA jest odwrotnie transkrybowane do DNA i włączane do genomu gospodarza, powodując ekspresję białek sygnałowych w komórkach testowych.
Wprowadzić enzymy, aby oderwać OPC od substratu.
Zneutralizuj enzymy i odwiruj, aby usunąć enzymy.
Dodaj pożywkę wzrostową i przenieś OPC na szkiełka nakrywkowe wewnątrz mikropłytki z przylegającym zwojem korzenia grzbietowego lub neuronami DRG. Pozwól, aby OPC się ustabilizowały.
Napełnij studzienki pożywką wzrostową i inkubuj. Interakcja z neuronami DRG wyzwala dojrzewanie OPC do oligodendrocytów.
Ekspresja białek sygnałowych indukuje oligodendrocyty do tworzenia osłonek mielinowych wokół neuronów DRG.
Oceń tworzenie się osłonki mielinowej indukowanej białkiem sygnałowym w komórkach badanych w porównaniu z komórkami transdukowanymi wektorem kontrolnym.
W tym protokole należy mieć pierwszorzędowe komórki prekursorowe oligodendrocytów, OPC, hodowane na 10-centymetrowych płytkach z 10 mililitrami pożywki SATO zawierającej następujące czynniki wzrostu - CNTF, PDGF, NT3 i forskolinę. Komórki musiały być hodowane przez 24 godziny w temperaturze poniżej 8% dwutlenku węgla.
Zacznij od zassania nośnika i całkowicie go usuń. Następnie zastąp go 10 mililitrami tego samego podłoża z czynnikami wzrostu. Zainfekuj swoje OPC lentiwirusem, wyrażając interesujące Cię białko poprzez kroplowe dodawanie wymaganej objętości wirusa do pożywki.
Ponadto, w osobnej płytce OPC, wymieszaj kontrolny lentiwirus, który wyraża tylko GFP z pożywką. Hoduj komórki przez kolejne 48 godzin, a następnie zbierz OPC z płytek w celu wysiewu na hodowane neurony DRG.
Najpierw dwukrotnie przepłucz każdą płytkę 8 mililitrami EBSS. Uzupełnij 1 mililitr trypsyny-EDTA 0,05% z 9 mililitrami ciepłego EBSS. Dodaj 5 mililitrów rozcieńczonej trypsyny do każdej płytki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do dwóch minut. Zneutralizuj trypsynę, dodając 5 mililitrów 30% FBS do EBSS.
Następnie za pomocą 10-mililitrowej pipety zmyj OPC z powierzchni płytki. Za każdym razem obracaj płytkę o ćwierć obrotu, aby zebrać wszystkie komórki. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w temperaturze 180 g.
Teraz odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w mililitrze ciepłej pożywki SATO bez czynników wzrostu i policzyć komórki. Następnie przygotuj neurony DRG, które są hodowane na 22-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych, całkowicie odsysając pożywkę z ich płytki.
Następnie delikatnie wysiew 200 000 OPC, kroplami, do każdego szkiełka nakrywkowego. Objętość wysiewu musi być mniejsza niż 200 mikrolitrów na szkiełko nakrywkowe. Pozwól komórkom osiąść bez przesuwania płytki. Po 10 minutach przykryj każdą studzienkę mililitrem ciepłej pożywki SATO. Teraz ponownie pokryj pozostałe siostrzane OPC pożywką SATO zawierającą czynniki wzrostu. Można je później wykorzystać do weryfikacji ekspresji interesującego białka.