Izolowanie fałdów nerwowych czaszki od zarodka kurcząt w celu hodowli komórek grzebienia nerwowego

Weź zarodek pisklęcia wsparty w ramce z bibuły filtracyjnej i umieść go pod mikroskopem preparacyjnym

.

Usuń błonę witelinową, ochronną powłokę otaczającą zarodek.

Zidentyfikuj fałdy nerwowe śródmózgowia znajdujące się za płatami wzrokowymi i przed półksiężycem serca, embrionalnym prekursorem dojrzałego serca.

Fałdy nerwowe zawierają przedmigracyjne komórki grzebienia nerwowego, które są multipotencjalnymi komórkami macierzystymi, które podczas rozwoju przekształcają się w komórki migrujące.

Te migrujące komórki różnicują się w komórki neuronalne i nieneuronalne.

Wyciąć najbardziej grzbietową część fałdów nerwowych i przenieść tkankę do naczynia hodowlanego zawierającego bufor.

Następnie umieść szkiełka nakrywkowe pokryte białkiem adhezyjnym w studzienkach na płytkach hodowlanych zawierających pożywkę.

Przenieś fałdy nerwowe na powlekane szkiełka nakrywkowe. Inkubować, aby ułatwić przyczepianie się do tkanek.

Podczas hodowli migrujące komórki grzebienia nerwowego wyłaniają się z fałdów nerwowych na pokrytą powierzchnię, tworząc hodowlę komórek grzebienia nerwowego.

Przenieść zarodek do czystego naczynia zawierającego roztwór Pen-Strep Ringera. Delikatnie przesuwaj zarodek w przód iw tył, aby usunąć żółtko, które zasłania widok, i wymień roztwór Pen-Strep Ringera lub przenieś go do świeżego naczynia, jeśli stanie się mętny. Umieść zarodek grzbietowo i ramą do góry pod mikroskopem preparacyjnym. Pozostaw zarodek na papierowej ramce, aby był rozciągnięty i utrzymany na miejscu.

Następnie usuń błonę witelinową za pomocą kleszczy, aby odsłonić fałdy nerwowe. Obejmują tkankę ogonową do rozszerzających się pęcherzyków wzrokowych i rostralną do tyłomózgowia, gdzie zwężenia rombomerów dopiero zaczynają się pojawiać. Za pomocą nożyczek sprężynowych ostrożnie wytnij fałdy nerwowe śródmózgowia. Należy zwrócić uwagę, aby wyciąć grzbietową część fałdu nerwowego przy minimalnym zanieczyszczeniu cewy nerwowej i nienerwowej ektodermy, a następnie przenieść fałdy nerwowe do czystego naczynia zawierającego roztwór Pen-Strep Ringera za pomocą pipety P20 lub sterylnej szklanej pipety Pasteura przepłukanej żółtkiem roztworu Pen-Strep Ringera.

Przechowuj zebrane fałdy na lodzie podczas preparowania dodatkowych fałd. Po wyjęciu szalki hodowlanej z inkubatora użyj pipety lub pipety Pasteura, aby usunąć roztwór fibronektyny z naczynia lub studzienki nakrywkowej. Po przepłukaniu podłoża pokrytego fibronektyną roztworem Pen-Strep Ringera, dodaj odpowiednią objętość kompletnej pożywki hodowlanej do naczynia lub studzienki.

Aby zablokować plastik i zapobiec przywieraniu chusteczki, użyj pipetora P20 lub P200 i przepłucz końcówkę pipety roztworem żółtka Ringera. Następnie przenieś izolowane fałdy nerwowe w kierunku środka szkiełka nakrywkowego pokrytego fibronektyną, uważając, aby przenieść jak najmniej roztworu Pen-Strep Ringera. Po pozostawieniu eksplantatów na 10 do 15 minut, umieść je w wilgotnej komorze o temperaturze 38 stopni Celsjusza, powoli i ostrożnie przenosząc naczynie hodowlane z platerowanymi fałdami nerwowymi.