Izolowanie neuronów zwoju przedsionkowego od ucha wewnętrznego myszy

Weź połowę głowy szczeniaka myszy i usuń mózg.

Przetnij górną część czaszki i wytnij otaczającą tkankę, aby uwidocznić torebkę uszną, kostną warstwę zewnętrzną chroniącą struktury ucha wewnętrznego.

Przenieść tkankę na płytkę hodowlaną zawierającą buforowane podłoże.

Oddziel górne i dolne zwoje przedsionkowe, które zawierają ciała komórek nerwowych przedsionkowych.

Ogol kostny grzbiet i zbierz leżący pod nim górny ganglion.

Przenieść zwój górny na świeżą płytkę zawierającą zbuforowane podłoże.

Usuń przylegające tkanki z powierzchni, aby oczyścić izolowany ganglion.

Umieść ganglion w roztworze zawierającym enzymy proteolityczne.

Enzymy degradują macierz zewnątrzkomórkową tkanki, rozluźniając komórki.

Przenieś ganglion do pokrytego polimerem naczynia ze szklanym dnem zawierającego pożywkę hodowlaną i mechanicznie zdysocjuj tkankę, aby uwolnić komórki.

Inkubuj, pozwalając komórkom przylegać i ustanowić hodowlę neuronów zwoju przedsionkowego.

Wyjmij mózg uśpionej myszy za pomocą zamkniętych nożyczek chirurgicznych. Przeciąć i usunąć nerw czaszkowy, aby całkowicie odłączyć mózg od czaszki. Zaczynając od tyłu głowy, ściągnij przezroczysty błoniasty materiał kleszczami, a następnie odetnij górną część czaszki za pomocą nożyczek chirurgicznych.

Usuń nadmiar tkanki z tyłu głowy i szyi, aby obszar sekcji i torebka uszna były czystsze i łatwiej dostępne. Przenieść tkankę na drugą szalkę Petriego ze świeżym roztworem L-15. Następnie zlokalizuj torebkę uszną oraz nerwy słuchowe, przedsionkowe górne i przedsionkowe dolne. Oddziel górne i dolne zwoje za pomocą małych nożyczek sprężynowych i odetnij nerw słuchowy.

Za pomocą skalpela delikatnie ogol kostny grzbiet, aby osłabić obszar kostny, pod którym nerw zanurza się w kostnej torebce. Ostrożnie usuń zanieczyszczenia skalpelem, odsłaniając całą spuchniętą część ganglionu.

Użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby przeciąć i oddzielić ganglion od gałęzi nerwu obwodowego, która nurkuje w kierunku łagiewki. Usuń górny ganglion za pomocą drobnych kleszczy i przenieś go na 35-milimetrową szalkę Petriego ze świeżym roztworem L-15.

Po wstępnym podgrzaniu roztworu enzymatycznego wlej mieszaninę enzymów na 35-milimetrową szalkę Petriego i umieść ją w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut. Oczyść ganglion za pomocą cienkich kleszczy i małych nożyczek sprężynowych, usuwając kość, nadmiar tkanki, włókna nerwowe i wszelkie inne zbędne struktury. Uważaj, aby zminimalizować usunięcie tkanki zwojowej.

Przenieś oczyszczone zwoje mózgowe do podgrzanego roztworu enzymu i umieść go z powrotem w inkubatorze na 10 do 40 minut. Następnie przenieś zwoje na 35-milimetrową szalkę Petriego ze świeżym roztworem L-15.

Po dwóch do trzech minutach przenieś zwoje na inną 35-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną przefiltrowaną pożywką hodowlaną. Przenieś około 150 mikrolitrów przefiltrowanej pożywki hodowlanej na naczynie z powlekanym szklanym dnem. Następnie przenieś żądaną liczbę zwojów jaj na szkiełko nakrywkowe.

Pobrać niewielką ilość pożywki hodowlanej z naczynia hodowlanego i przepłukać pipetę do rozcierania pożywką, aby zapobiec przywieraniu tkanki do boków szklanej pipety. Delikatnie i wielokrotnie przepuszczać tkankę przez pipetę, aż zwoje zostaną wystarczająco zdysocjowane.

Po pięciu minutach sprawdź pod mikroskopem świetlnym, czy komórki osiadły na szkiełku nakrywkowym. Ostrożnie umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 do 24 godzin.