Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych z zarodka myszy

Weźmy transgeniczną ciężarną mysz i chirurgicznie usuńmy macicę z zarodkami zawierającymi fluorescencyjnie znakowane neurony ruchowe.

Przenieś macicę do naczynia z lodowatym buforem pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Użyj światła widzialnego, aby wyizolować zarodki.

Usuń pysk i ogon zarodków i ustaw je w pozycji leżącej.

Korzystając z sygnału fluorescencyjnego, wykonaj nacięcie w śródmózgowiu, aby odsłonić jądra okoruchowe i bloczkowe, które zawierają neurony ruchowe.

Wyizoluj śródmózgowie zawierające jądra.

Otwórz grzbietową stronę tyłomózgowia i rdzeń kręgowy. Odizoluj rdzeń kręgowy, wytnij oba końce i zbierz kolumny zawierające rdzeniowe neurony ruchowe.

Potraktuj pobrane tkanki enzymami, aby zdysocjować macierz tkankową. Zbierz pojedyncze komórki i wyizoluj fluorescencyjnie znakowane neurony za pomocą FACS.

Dodaj pożywkę hodowlaną do izolowanych neuronów, przenieś komórki na mikropłytkę pokrytą substratem hodowlanym i inkubuj, pozwalając komórkom przylegać i rosnąć.

Utrzymuj neurony ruchowe w kulturze.

Zacznij od pobrania zarodków Islet-1 EGF-dodatnich od ciężarnej myszy około 11,5 dnia po zapłodnieniu. Dokładnie spryskaj brzuch etanolem i usuń macicę sterylnymi nożyczkami do mikrodysekcji i kleszczami do opatrunku kciuka. Krótko umyj macicę w sterylnym PBS. Następnie przenieś go na płytkę separacyjną wypełnioną wstępnie schłodzonym sterylnym PBS.

W jasnym świetle mikroskopu ostrożnie usuń zarodki z macicy za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, kleszczy do opatrunku kciuka i pęsety Dumont Numer 5. Następnie użyj sterylnej mini-perforowanej łyżki Moria, aby przenieść każdy zarodek do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce wypełnionej wstępnie schłodzoną pożywką Hibernate E o niskiej fluorescencji uzupełnioną 1X V27.

Trzymając płytkę na lodzie, przenieś jeden zarodek na sterylną płytkę separacyjną i przykryj ją całkowicie lodowatym sterylnym roztworem soli Hanka lub HBSS. Użyj pęsety, aby usunąć twarz zarodka i ogon bez uszkadzania śródmózgowia. Następnie umieść zarodek na brzuchu z kończynami okrakiem i ogonem skierowanym w stronę przodu mikroskopu.

Użyj pęsety, aby rozciąć dach czwartej komory, aby wytworzyć mały otwór. Użyj tego otworu, aby zaczepić pęsetę w przestrzeni utworzonej między czwartą komorą a jej dachem. Rozkrój wzdłuż grzbietowej powierzchni zarodka rostralnego do kory i bocznie do płyty podłogowej i kolumny motorycznej.

Następnie otwórz wypreparowaną tkankę w sposób otwarty, aby odsłonić jądra CN3 i CN4 GFP-dodatnie. Ostrożnie oddziel brzuszne śródmózgowie od zarodka i usuń tkankę oponową za pomocą pęsety i noża do mikrodysekcji.

Wypreparuj obustronne jądra CN3 i CN4 GFP-dodatnie z dala od płytki podłogowej i innych otaczających tkanek GFP-dodatnich, uważając, aby nie dotykać ani nie uszkadzać neuronów. W przypadku pobierania oddzielnych jąder CN3 i CN4, przeciąć wzdłuż śródmózgowia tych dwóch jąder i użyć pipety P1000, aby pobrać wypreparowaną brzuszną tkankę śródmózgowia przy minimalnym HBSS.

Umieść go w oznakowanej 1.7-mililitrowej probówce mikrowirówkowej wypełnionej pożywką preparacyjną. Przechowywać probówkę na lodzie do czasu dysocjacji. Kontynuuj łączenie brzusznego śródmózgowia z dodatkowych zarodków w tej samej probówce, aż całkowita liczba spełni wymagania eksperymentalne.

Aby wypreparować brzuszny rdzeń kręgowy, trzymaj zarodek w pozycji leżącej z głową skierowaną do przodu mikroskopu. Przytrzymaj go jedną parą pęsety i włóż końcówkę drugiej pary do nieotwartej części ogonowej czwartej komory. Otwórz resztę tyłomózgowia i rdzeń kręgowy grzbietowo na całej długości ogonowej zarodka. Przetnij tkankę grzbietową, zaczynając od czwartej komory i kierując się w stronę centralnego kanału ogonowego rdzenia kręgowego, używając kleszczy jako nożyczek.

Następnie przytrzymaj zarodek jednym zestawem pęsety i ściśnij płat tkanki grzbietowej z każdej strony drugą parą. Usuń brzuszny rdzeń kręgowy za pomocą noża do mikrodysekcji, aby przebić się bezpośrednio pod GFP-dodatnim SMN, podnosząc brzuszny rdzeń kręgowy ruchami przypominającymi piłę po obu stronach.

Przeciąć rdzeń kręgowy poprzecznie na górnej granicy kończyny dolnej i usunąć część lędźwiową szyjną. Przeciąć poprzecznie bezpośrednio nad C1, gdzie wystaje pierwszy przedni róg GFP-dodatni. Umieść brzuszny rdzeń kręgowy grzbietową stroną do góry i przytrzymaj go, naciskając tkankę GFP-ujemną między kolumnami GFP-dodatnich SMN za pomocą pęsety.

Usuń pozostałą przyczepioną mezenchymę, DRG i grzbietowy rdzeń kręgowy, przycinając obie strony kolumny SMN GFP-dodatniej za pomocą noża do mikrodysekcji. Użyj pipety P1000, aby zebrać wypreparowaną tkankę brzusznego rdzenia kręgowego z minimalnym HBSS i umieść ją w oznakowanej 1,7-mililitrowej probówce do mikrowirówki wypełnionej pożywką do preparacji. Przechowuj go na lodzie do momentu dysocjacji i kontynuuj gromadzenie brzusznych rdzeni kręgowych z dodatkowych zarodków w tej samej probówce.

Dodać odpowiednią objętość roztworu papainy do każdej z probówek do mikrowirówek z wypreparowanymi próbkami tkanek. Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, mieszając probówki co 10 minut, przesuwając palcem.

Po inkubacji delikatnie rozetrzeć każdą zawiesinę osiem razy pipetą P200. Odwiruj go 300 razy g przez pięć minut. Zawiesić osady komórkowe z odpowiednią objętością roztworu inhibitora albuminy owomukoidów, delikatnie pipetując w górę iw dół. Powtórzyć wirowanie. Następnie ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety P1000. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki preparyjnej. Przefiltruj zawiesiny przez sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów.

Następnie użyj sortowania FACS, aby wyizolować komórki GFP-dodatnie wypreparowane z CN3, CN4 i SMN. Rozcieńczyć izolowane zawiesiny komórkowe pożywką do hodowli neuronów ruchowych wstępnie ogrzaną do 37 stopni Celsjusza do odpowiedniej gęstości i dodać 200 mikrolitrów zawiesiny do studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej lamininą PDL. Hoduj neurony w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, pamiętając o odświeżaniu pożywki do hodowli neuronów ruchowych co pięć dni.