Różnicowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych w progenitory neuronów i astrocytów

Zacznij od nieprzylegających neurosfer, trójwymiarowego agregatu ludzkich nerwowych komórek macierzystych w pożywce pochodzącej z hodowli komórkowej.

Pożywka ta zawiera składniki odżywcze, czynniki wzrostu i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, które utrzymują żywotność komórek.

Wirówka w celu zebrania neurosfer.

Potraktuj je trypsyną i enzymami DNazy, wymieszaj zawartość, a następnie inkubuj.

Trypsyna zaburza adhezję między komórkami i ułatwia odrywanie komórek, podczas gdy DNaza degraduje wolne DNA, zapobiegając zlepianiu się komórek.

Kilkakrotnie odpipetować zawartość, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Następnie dodaj inhibitor trypsyny, aby zneutralizować aktywność enzymu.

Odwirować i usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce proliferacyjnej zawierającej neuronalne czynniki wzrostu.

Zawiesinę komórek należy umieścić na pokrytym polimerem szkiełku nakrywkowym umieszczonym na płytce wielodołkowej. Inkubować, aby umożliwić przyczepienie się komórek macierzystych do polimeru.

Ponadto, w oparciu o wchłanianie określonych czynników wzrostu, komórki macierzyste różnicują się w progenitory nerwowe i astrocyty, które są gotowe do dalszego dojrzewania w wyspecjalizowane typy komórek.

Po przygotowaniu pożywki hodowlanej i posianiu ludzkich nerwowych komórek macierzystych zgodnie z protokołem tekstowym, należy pobrać z inkubatora kolbę z komórkami, które mają zostać pasażowane, i przenieść ją do komory bezpieczeństwa biologicznego lub BSC. Delikatnie przechylić kolbę, pozwalając komórkom opaść na dno zebranego podłoża.

Przenieś 10 mililitrów pożywki do dwóch 5-mililitrowych porcji do czystej 15-mililitrowej probówki oznaczonej "CM" dla kondycjonowanego podłoża. Należy uważać, aby nie zasysać żadnej z komórek znajdujących się w kolbie. Przenieś 3 mililitry pożywki z probówki CM do 15-mililitrowej probówki oznaczonej jako "roztwór inhibitora trypsyny". Następnie odłóż rurkę CM na bok.

Następnie usuń 5 mililitrów pożywki i komórek pozostałych w kolbie T75 i umieść ją w czystej 15-mililitrowej probówce oznaczonej jako "komórki". Następnie, używając pipety serologicznej i 3,5-mililitrowej objętości CM, dwukrotnie przepłukać kolbę T75, przenosząc płukanie CM do probówki "komórek". Spowoduje to usunięcie wszystkich neurosfer z kolby T75.

Odwirować probówkę "komórek" o ciśnieniu 100 g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas wirowania komórek należy pobrać przygotowany wcześniej roztwór glukozy DPBS z łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodać odpowiednią ilość trypsyny i DNazy.

Po tym, jak probówka "komórek" przestanie się obracać, usuń cały kondycjonowany supernatant pożywki i przenieś go do probówki CM. Dodaj roztwór trypsyny do osadu komórkowego w 15-mililitrowej probówce i użyj 5-mililitrowej pipety do pipetowania w górę iw dół około 5 do 10 razy. Zamknij nakrętkę probówki i inkubuj ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Do probówki z inhibitorem trypsyny dodać odpowiednią objętość inhibitora trypsyny, dodając taką samą objętość roztworu, jaka została użyta do roztworu trypsyny. Następnie umieść roztwór inhibitora trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny.

Po inkubacji pipetować komórki w górę i w dół od 5 do 10 razy. Następnie inkubować próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 10 do 15 minut. Po inkubacji komórek pipetuj komórki w górę i w dół, aż kulki zostaną całkowicie zdysocjowane. Następnie natychmiast dodaj roztwór inhibitora trypsyny i pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół 10 razy.

Aby policzyć liczbę komórek w zawiesinie, należy odpipetować 15 mikrolitrów premiksu błękitu trypanowego na małą łódkę wagową i dodać 5 mikrolitrów zawiesiny komórek. Pipetuj w górę i w dół 3 do 5 razy, aby wymieszać. Następnie przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny niebieskich krwinek trypanowych na obie strony hemocytometru, przykryte szklanym szkiełkiem nakrywkowym.

Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym i policz całkowitą liczbę komórek w każdej z czterech siatek narożnych. Następnie dodaj te liczby do siebie. Po obliczeniu liczby komórek zgodnie z protokołem tekstowym, dodać objętość zawiesiny komórek do każdej kolby T75, aby uzyskać 5 x 10⁶ komórek na kolbę.

Jeśli objętość jest mniejsza niż 5 mililitrów, dodaj dodatkowe kondycjonowane podłoże do 5 mililitrów. Następnie dodać do kolby 10 mililitrów nowej pożywki DFHGFPS zawierającej czynniki wzrostu. Upewnij się, że kolba jest oznaczona typem komórek, datami, liczbą komórek w kolbie i numerem przejścia. W razie potrzeby w tym momencie inkubuj komórki.

Aby przykleić HNSC do płytki, dzień przed pasażem, wyczyść BSC zgodnie z opisem w protokole tekstowym i użyj kleszczy, aby umieścić pojedyncze sterylne 12-milimetrowe szklane szkiełka nakrywkowe w dołkach 24-dołkowej płytki. Pokryj studzienki szkiełkami nakrywkowymi z 250 mikrolitrami na studzienkę 0,01% poli-D-lizyny lub PDL w sterylnej wodzie i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Usuń PDL z dołków, a następnie pokryj je 1 mikrogramem na centymetr kwadratowy lamininy DPBS.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Jeśli nie jest to potrzebne następnego dnia, owiń parafilm wokół krawędzi płytki, aby ją uszczelnić i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usuń nadmiar roztworu lamininy ze studzienek poprzez aspirację i użyj 0,5 mililitra DPBS do jednokrotnego przepłukania studzienek. Następnie zasiej komórki do każdej studzienki o gęstości od 0,6 do 1 x 10⁵ komórek na centymetr kwadratowy.