Generowanie organoidów mózgowych typu przodomózgowia z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Zacznij od płytki studzienkowej o niskim przyleganiu, zawierającej indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste lub iPSC w pożywce z komórek macierzystych uzupełnionej inhibitorem kinazy Rho.

Inhibitory wnikają do komórek, blokują enzymy kinazy Rho i utrzymują żywotność komórek. Sprzyja to tworzeniu się agregatów iPSC.

Zastąp pożywkę pożywką z komórek macierzystych, aby umożliwić wzrost agregatów. Przenieś je do naczynia hodowlanego o niskim przyczepie z korową pożywką indukcyjną.

Składniki tej pożywki powodują, że iPSC różnicują się w komórki neuroektodermalne, prekursor neuronalny.

Przenieś każdy agregat neuroektodermalny na folię z płytkimi studzienkami.

Zastąp pożywkę matrycą z membraną podstawną i inkubuj, aby umożliwić zestalenie matrycy i uwięzienie agregatów.

Przenieść te zagregaty osadzone w matrycy do naczynia zawierającego pożywkę indukcyjną kory mózgowej i inkubować z mieszaniem.

Z biegiem czasu komórki neuroektodermalne wykorzystują czynniki różnicujące i przekształcają się w komórki neuronabłonkowe.

Zmień pożywkę na pożywkę różnicowania organoidów, która pozwala komórkom dojrzeć do bardziej wyspecjalizowanych typów komórek, tworząc organoid mózgowy przypominający korę przodomózgowia.

Aby wygenerować pluripotencjalne agregaty komórek macierzystych, gdy kultury komórek macierzystych osiągną zbieżność od 70% do 90%, dodaj 500 mikrolitrów odczynnika do dysocjacji komórek do jednego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej, aby odłączyć komórki.

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, które są przystosowane do warunków hodowli jednowarstwowej, są dobrym typem komórek do generowania agregatów, ponieważ są mniej podatne na śmierć komórek wywołaną stresem podczas procedury dysocjacji i agregacji.

Po 5 do 10 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza delikatnie postukaj w płytkę i użyj 2 mililitrów DMEM/F-12, aby umyć komórki z dna studzienki. Przenieś powstałą zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki i zwiększ objętość roztworu komórkowego do 10 mililitrów za pomocą większej ilości pożywki DMEM / F-12.

Po zliczeniu przenieś 4,5 razy 10 do trzeciej komórki na pluripotencjalne skupisko komórek macierzystych do nowej 15-mililitrowej probówki i zbierz komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości pluripotencjalnej pożywki z komórek macierzystych, uzupełnionej 50 mikromolowym inhibitorem ROCK, aby uzyskać stężenie 4,5 x 10³ komórek na 150 mikrolitrów podłoża.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów komórek do pojedynczych studzienek 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U o niskim stopniu mocowania i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Do monitorowania indukcji neuroektodermy przedniej należy używać mikroskopu hodowli tkankowej, aby codziennie dokładnie obserwować zmiany morfologiczne agregatów pluripotencjalnych komórek macierzystych w małym powiększeniu.

W dniu 1 należy obserwować agregaty komórkowe z wyraźnymi granicami. W drugim dniu ostrożnie odessać około 2/3 pożywki bez naruszania agregatów komórkowych na dnie każdej studzienki i zastąpić wyrzuconą pożywkę 100 mikrolitrami świeżej pożywki z pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Między czterema a sześcioma dniami później, gdy agregaty komórek osiągną średnicę od 350 do 450 mikrometrów i będą miały gładkie krawędzie, użyj zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby przenieść do 20 kruszyw do jednej 6-centymetrowej płytki hodowlanej o niskim mocowaniu, zawierającej 5 mililitrów korowej pożywki indukcyjnej.

Wymieniaj pożywkę indukcyjną kory mózgowej na świeżą pożywkę raz na trzy dni, codziennie monitorując morfologię agregatów pod obiektywem 4x. Po czterech do pięciu dniach w pożywce indukcyjnej kory mózgowej krawędzie agregatów komórkowych powinny zacząć rozjaśniać się na powierzchni, wskazując na różnicowanie neuroektodermalne i powinna pojawić się promienista organizacja pseudostratyfikowanego nabłonka.

Aby osadzić agregaty neuroektodermalne w rusztowaniu matrycy, napełnij ekstrakt z błony podstawnej lodem na dwie do trzech godzin. Podczas rozmrażania ekstraktu użyj sterylnych nożyczek, aby pociąć plastikową folię parafinową na jeden kwadrat o wymiarach 4 na 4 centymetry na 16 organoidów i umieść każdy kawałek filmu na pustej tacce na końcówki do mikropipet o pojemności 100 mikrolitrów.

Naciśnij folię parafinową opuszkiem palca w rękawiczce, aby pojawiły się małe wgłębienia, i wyczyść folię 70% etanolem. Po naświetlaniu promieniami UV w zamkniętej, sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut, należy użyć zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów z otworem o średnicy 1 i 1/2 do 2 milimetrów, aby przenieść każdy agregat komórek do jednego wgłębienia w folii.

Po przeniesieniu wszystkich agregatów użyj nieoszlifowanej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby ostrożnie zassać pożywkę z każdego wgłębienia i dodać 40 mikrolitrów nierozcieńczonego ekstraktu z błony podstawnej do każdego agregatu komórek.

Należy uważać, aby nie uszkodzić organoidów przez brutalną manipulację lub zasysanie do końcówki pipety, ponieważ spowoduje to uszkodzenie rozwijającego się nabłonka nerwowego.

Użyj końcówki pipety, aby umieścić kruszywo w środku każdej kropli i użyj sterylnych kleszczyków, aby ostrożnie przenieść plastikowy arkusz folii parafinowej na 10-centymetrową szalkę Petriego. Umieść naczynie w inkubatorze na 15 do 20 minut.

Podczas gdy ekstrakt krzepnie, dodaj 5 mililitrów świeżej pożywki do indukcji korowej do jednego sześciocentymetrowego naczynia hodowlanego o niskim przyczepie. Pod koniec inkubacji odwróć arkusz folii parafinowej i za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie wyciśnij do 16 spolimeryzowanych kropelek do każdej 6-centymetrowej naczynia. Następnie należy zwrócić agregaty do inkubatora do hodowli komórkowych.

Następnego dnia przenieś szalki z kulturami organoidów na kołyszącą się wytrząsarkę do kultur komórkowych nachyloną pod kątem 5 stopni z prędkością 14 obr./min w inkubatorze do hodowli komórkowych z codziennym monitorowaniem mikroskopii świetlnej, aż agregaty osiągną interesujący je etap różnicowania.