Izolowanie komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej myszy

Weźmy mysi odcinek jelita cienkiego uprzednio pozbawiony mięśnia podłużnego i splotu mięśniowo-jelitowego, warstw zawierających neurony jelitowe i komórki glejowe.

Pokrój tkankę i umieść ją w buforze zawierającym EDTA. Inkubuj z kołysaniem.

EDTA zakłóca połączenia komórka-komórka, odrywając błonę śluzową nabłonka od leżącej poniżej blaszki właściwej i błony podśluzowej, warstw tkanki łącznej zawierających komórki glejowe jelitowe.

Kilkakrotnie pipetować, aby usunąć komórki nabłonka.

Przefiltrować przez sitko do komórek i odrzucić przepływ.

Przenieś tkankę do nieenzymatycznego buforu dysocjacyjnego i inkubuj ją z kołysaniem. Bufor dysocjacyjny rozluźnia blaszkę właściwą i podśluzówkową macierz zewnątrzkomórkową, odłączając komórki.

Kilkakrotnie pipetować, aby jeszcze bardziej zdysocjować komórki.

Przefiltruj przez sitko do komórek, aby zebrać komórki.

Odwirować i ponownie zawiesić komórki w buforze.

Weź studzienki pokryte białkiem adhezyjnym zawierające pożywkę wzrostową glejową i umieść komórki na płytce.

Powłoka ułatwia adhezję komórek, podczas gdy czynniki wzrostu selektywnie promują proliferację komórek glejowych, tworząc blaszkę właściwą i hodowlę komórek glejowych podśluzówkowych.

Aby usunąć błonę śluzową nabłonka, najpierw użyj cienkich nożyczek, aby pociąć jelita na około 0,5-centymetrowe kawałki i zbierz kawałki w 30 mililitrach lodowatego roztworu EDTA/HEPES/DPBS. Kołysz roztworem zawierającym tkanki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut z około 60 przechyleniami na minutę.

Wstępnie zwilż 5-mililitrową plastikową pipetę, pipetując raz bufor EDTA/HEPES/DPBS w górę iw dół, a następnie użyj wstępnie zwilżonej pipety, aby 20 razy rozcierać tkankę i buforować zawiesinę, aby usunąć błonę śluzową nabłonka.

Zbierz tkankę, przelewając mieszaninę przez 100-mikronowe nylonowe sitko do komórek i użyj kleszczyków do igieł, aby umieścić tkankę zatrzymaną w sitku w nowej 50-mililitrowej stożkowej probówce wirówkowej zawierającej 30 mililitrów lodowatego EDTA/HEPES/DPBS. Powtórz inkubację EDTA/HEPES/DPBS po raz drugi, kołysząc tkanką w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut z około 60 nachyleniami na minutę, aby usunąć dodatkową błonę śluzową nabłonka.

Wykonaj delikatne rozcieranie za pomocą wstępnie zwilżonej pipety o pojemności 5 mililitrów. Tkanka będzie miała tendencję do przyklejania się do wnętrza pipety w miarę usuwania większej ilości nabłonka.

W tym momencie wymagane jest delikatne rozcieranie, ponieważ komórki glejowe jelit są bardziej kruche.

Zebrać tkankę po drugiej inkubacji, przelewając mieszaninę przez sitko do komórek nylonowych o grubości 100 mikronów i odrzucić przepływ. Drugi przepływ powinien być zauważalnie mniej mętny niż pierwszy. Powtarzaj 10-minutowe inkubacje EDTA, aż roztwór będzie prawie klarowny.

Przenieś tkankę z nylonowego sitka do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej zawierającej 5 mililitrów dostępnego w handlu roztworu do odzyskiwania komórek. Następnie kołysz się przez 25 do 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Delikatnie rozcieraj 10 razy, aby oddzielić komórki glejowe jelita od blaszki właściwej, a następnie przefiltruj przez filtr 40 mikronów i zbierz filtrat do czystej 50-mililitrowej probówki.

Opłucz chusteczkę na nylonowym filtrze 1 mililitrem DPBS. Wyrzuć tkankę i przenieś 5 do 6 mililitrów filtratu do czystej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Wirować filtrat z prędkością 2000 g w wirówce kubełkowej przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Zawiesić osad zawierający komórki glejowe w co najmniej 1 mililitrze buforu do sporządzania zawiesiny, delikatnie pipetując osad w górę iw dół za pomocą końcówki pipety o pojemności 500 mikrolitrów bez wprowadzania pęcherzyków. Na koniec płytkie komórki gleju jelitowego, dodając 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 6-dołkowej płytki pokrytej lamininą lub 100 mikrolitrów do każdej studzienki 12-dołkowej płytki zawierającej pożywkę glejową.