Metoda izolacji jednostek nerwowo-naczyniowych z mózgu szczura

Zacznij od zimnej szklanej zaprawy zawierającej tkankę korową mózgu szczura, która jest najbardziej zewnętrzną warstwą mózgu.

Dodaj bufor mikronaczyń mózgowych lub BMB, zawierający inhibitory proteazy.

Teraz poruszaj tłuczkiem w górę iw dół, aby oddzielić tkankę.

To pobudzenie uwalnia jednostki nerwowo-naczyniowe lub NVU, składające się z mikronaczyń, perycytów, neuronów i komórek glejowych. Inhibitory proteazy blokują uwalniane proteazy, chroniąc mikronaczynia.

Przenieś tę mieszaninę do probówki.

Dodaj gęsty roztwór polisacharydu. Użyj wiru, aby równomiernie wymieszać roztwór z pozostałą zawartością.

wirówka. Gęste polisacharydy umożliwiają sedymentację NVU, które są gęstsze niż szczątki tkankowe.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić NVU w BMB zawierającym inhibitor proteazy i roztwór polisacharydów.

Użyj wiru, aby wymieszać zawartość.

Powtórz proces wirowania. Wyrzucić supernatant w celu usunięcia wszelkich pozostałości zanieczyszczeń.

Zawieś ponownie NVU w BMB i przechowuj je do dalszej analizy.

Umieść tkankę mózgową kory mózgowej w schłodzonym szklanym moździerzu. Następnie dodaj 5 mililitrów BMB z koktajlem inhibitorów proteazy. Za pomocą górnego homogenizatora włóż tłuczek do moździerza i homogenizuj tkankę mózgową za pomocą 15 ruchów w górę iw dół przy 3,700 obr./min. Następnie wlej homogenat do oznakowanych probówek wirówkowych. Pomiędzy próbkami użyj 70% etanolu do czyszczenia tłuczka.

Aby przeprowadzić wirowanie, dodaj 8,0 mililitrów 26% roztworu dekstranu do każdej oznakowanej probówki wirówkowej zawierającej homogenat mózgu. Odwrócić probówkę dwukrotnie, a następnie dokładnie odwirować próbkę. Przeprowadź wirowanie każdej próbki pod różnymi kątami, aby zapewnić dokładne wymieszanie roztworu homogenatu mózgu z 26% roztworem dekstranu. Odwirować próbki w temperaturze 5 000 g i 4 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5,0 mililitrach BMB z koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie wymieszaj granulkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Następnie dodaj 8,0 mililitrów 26% dekstranu do każdej probówki wirówki i wiruj, jak pokazano poniżej. Następnie ponownie odwirować próbki.

Za pomocą kolby próżniowej i szklanej pipety odessać supernatant i upewnić się, że osad zawierający mikronaczynie mózgowe nie został naruszony. Zawiesić osad w BMB z inhibitorem proteazy, a następnie 26% dekstranem jeszcze dwa razy. Po końcowym odwirowaniu dodaj 5,0 mililitrów BMB do każdej granulki i wiruj, aby ponownie zawiesić próbkę.