Technika zbierania i dysocjacji zwojów korzenia grzbietowego dla kultur neuronalnych

Weź fragment kręgosłupa szczura i podziel go, aby usunąć rdzeń kręgowy.

Odłącz zwoje korzenia grzbietowego lub DRG, skupisko neuronów otoczone satelitarnymi komórkami glejowymi lub SGC.

Umieść DRG w pożywce wzrostowej. Usuń korzenie nerwowe, aby zmniejszyć zanieczyszczenie SGC.

Potraktuj kolagenazą, aby zdegradować macierz tkankową i umyć, aby usunąć enzymy.

Wprowadź trypsynę, aby zakłócić połączenia międzykomórkowe. Dodaj surowicę zawierającą białka, które dezaktywują trypsynę.

Dodaj pożywkę wzrostową i mechanicznie oddziel tkankę. Przefiltrować zawiesinę, aby wyizolować pojedyncze komórki i odwirować, aby usunąć resztki tkanek.

Ponownie zawieś komórki, aby ułożyć je warstwowo na podłożu o gradiencie gęstości i odwirować.

Neurony o większej gęstości osiadają na dnie, ułatwiając separację SGC.

Ponownie zawiesić neurony w pożywce hodowlanej. Przenieś je na dobrze pokryty substratem hodowlanym, umożliwiając przyczepienie komórek.

Suplement z czynnikami wzrostu nerwów dla przeżycia neuronów.

Aby uzyskać neurony DRG po pobraniu rdzenia kręgowego, zacznij od usunięcia wszelkich części grzbietowych, a następnie użyj sterylnych i ostrych nożyczek chirurgicznych, aby podzielić kręgosłup na pół wzdłuż osi podłużnej, odsłaniając tkankę rdzeniową. Przetnij kręgosłup na dwa mniejsze segmenty poniżej poziomu klatki piersiowej, a następnie użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie usunąć całą tkankę pępowinową, uważając, aby nie ciągnąć i nie usuwać korzeni DRG, które wyglądają jak białe włókna wychodzące bezpośrednio z kanałów.

Po usunięciu całej tkanki rdzeniowej użyj bardzo cienkich kleszczy, aby pociągnąć cały korzeń DRG, sięgając głęboko do kanałów kręgowych i uważając, aby nie uszkodzić korzeni zwojów. Umieść DRG na szalce Petriego o powierzchni 60 milimetrów kwadratowych zawierającej od 3 do 4 mililitrów pożywki F-12 szynki, uzupełnionej antybiotykami. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, użyj sterylnych kleszczy i skalpela, aby usunąć nadmiar korzeni nerwowych otaczających zwoje, aby zmniejszyć zanieczyszczenie komórek satelitarnych.

Następnie przenieś DRG na szalkę Petriego o powierzchni 35 milimetrów kwadratowych zawierającą 1,8 mililitra świeżej pożywki F-12 i dodaj 200 mikrolitrów roztworu podstawowego kolagenazy typu 4. Inkubować DRG przez godzinę, a następnie ostrożnie odessać pożywkę szklaną pipetą, uważając, aby nie zassać ani nie uszkodzić DRG.

Powtórz krok kolagenazy i umyj DRG pożywką F-12. Po drugim myciu dodaj 1,8 mililitra pożywki F12 i 200 mikrolitrów trypsyny do komórek, usuwając trypsynę i dodając 1 mililitr pożywki uzupełnionej 500 mikrolitrami FBS w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej. Następnie odessać pożywkę i delikatnie przemyć DRG trzykrotnie pożywką F-12, aby usunąć wszelkie ślady surowicy.

Teraz nakarm komórki 2 mililitrami świeżej pożywki F-12 i za pomocą szklanej pipety ostrożnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Pipetuj w górę i w dół od 8 do 10 razy, aby delikatnie rozdzielić neurony, a następnie pozwól, aby osad zgromadził się na dnie probówki. Gdy osad się osadzi, przenieś supernatant do nowej probówki i dodaj 2 mililitry świeżego podłoża F12 do osadu, powtarzając dysocjację mechaniczną i przenoszenie pożywki, aż zawiesina stanie się jednorodna.

Następnie trzykrotnie rozcierać zawiesinę komórkową, a następnie przefiltrować powstałą homogenizowaną zawiesinę przez sitko komórkowe o średnicy 100 mikronów do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwiruj komórki w 15-mililitrowej probówce. Podczas wirowania powoli pipetuj świeżo przygotowaną 15% albuminę surowicy bydlęcej do wnętrza 15-mililitrowej probówki trzymanej pod kątem 45 stopni, aby utworzyć stopniowy ślad białka, używając liczb na probówce jako odniesienia dla ścieżki formowania.

Następnie odessaj supernatant z komórek, oszczędzając ostatnie 500 mikrolitrów na ponowne zawieszenie osadu, i powoli dozuj komórki wzdłuż szlaku białkowego do nowej probówki. Po ponownym odwirowaniu komórek, ponownie zawieś osad w 1 mililitrze zmodyfikowanego podłoża BS i umieść komórki w małej objętości podłoża na 24-dołkowej płytce na dwie godziny. Gdy komórki się przyłączą, dodaj świeżą pożywkę BS uzupełnioną 50 nanogramami na mililitr czynnika wzrostu nerwów.