Izolowanie i hodowla perycytów mózgowych myszy

Dodaj bufor do tkanki mózgowej myszy i homogenizuj ją, aby uwolnić komórki i mikronaczynia.

Następnie dodać roztwór BSA-dekstranu do homogenatu. Wymieszaj i odwiruj, aby oddzielić składniki. Odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić mikronaczynia w buforze i przepuścić je przez filtr, usuwając większe naczynia.

Teraz odwirować filtrat i usunąć supernatant. Zawiesić mikronaczynia w buforze zawierającym DNA.

Dodaj enzymy proteolityczne, aby uwolnić komórki śródbłonka i perycyty.

DNazy degradują DNA.

Dodać bufor zawierający BSA, aby zatrzymać aktywność enzymu. Odwirować i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce i ułożyć je na płytce wielodołkowej pokrytej matrycą podstawową. Inkubuj, promując adhezję komórek.

Regularnie zmieniaj media.

Komórki śródbłonka tworzą monowarstwę i wspomagają wzrost perycytów.

Późniejsze pasażowanie komórek w pożywce perycytowej na pokrytej żelatyną płytce wielodołkowej wspomaga wzrost perycytów, jednocześnie eliminując komórki śródbłonka.

Zacznij od umieszczenia mózgu specyficznego, wolnego od patogenów cztero- do sześciotygodniowego samca myszy C57 black 6 na sterylnej, suchej, niestrzępiącej się chusteczce i za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką do usunięcia móżdżku, prążkowia i nerwów potylicznych. Użyj bawełnianego wacika, aby usunąć wszystkie widoczne opony mózgowe i odwróć tkankę mózgową do góry nogami. Otwórz płaty lekkimi ruchami na zewnątrz i usuń wszystkie widoczne naczynia krwionośne. Następnie umieść tkankę mózgową wolną od opon mózgowych na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 15 mililitrów zimnego buforu myjącego B.

Aby homogenizować tkankę, przenieś próbkę mózgu do probówki z moździerzem Dounce Tissue Grinder i dodaj 3 do 4 mililitrów buforu myjącego B do probówki. Użyj luźnego tłuczka, aby zmielić tkankę 55 razy. Następnie opłucz tłuczek buforem myjącym B i zmiel zawiesinę tkanek ciasnym tłuczkiem 25 razy. Pod koniec homogenizacji równomiernie podzielić zawiesinę między dwie 50-mililitrowe probówki i dodać 1,5-krotność objętości zimnego 30% dekstranu albuminy surowicy bydlęcej. Następnie energicznie potrząśnij rurkami, aby wymieszać gnojowicę.

Aby wyizolować frakcję naczyniową, należy osadzać komórki przez odwirowanie i przenieść supernatanty do dwóch nowych probówek. Przechowywać granulki w buforze myjącym B na lodzie. Zawiesić granulki w trzech mililitrach zimnego buforu myjącego B na lodzie.

Odwirować zebrane supernatanty i powtórzyć ten krok jeszcze raz. Wyrzuć supernatanty i ponownie zawieś granulki w 3 mililitrach buforu myjącego B. Następnie połącz ponownie zawieszone granulki i doprowadź końcową objętość połączonych zawiesin komórkowych do 10 mililitrów za pomocą świeżego zimnego buforu myjącego B.

Następnie odciąć komórki za pomocą 10-milimetrowej pipety sześć razy, aż nie będą widoczne żadne pozostałe grudki granulek, a następnie użyj zespołu filtra próżniowego i sitka z nylonowej siatki do przefiltrowania zawiesiny komórek. Umieść sitko na szalce Petriego i wyczyść siatkę świeżym buforem myjącym B i zeskrobaniem, aby odzyskać wszelkie naczynia włosowate. Następnie wykonaj drugą filtrację ze świeżym filtrem.

Podzielić filtrat równo między dwie probówki i zebrać komórki przez odwirowanie. Po odrzuceniu supernatantów, zebrać granulki w jednej probówce zawierającej wstępnie podgrzany bufor myjący B z enzymami i dodać do probówki wstępnie podgrzaną papę kolagenazy. Umieść probówkę w łaźni wodnej ze stołem wstrząsającym dokładnie na 33 minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie zatrzymaj reakcję za pomocą 30 mililitrów zimnego buforu myjącego B.

Zebrać komórki przez odwirowanie i ostrożnie wyrzucić supernatant. Szybko, ale ostrożnie ponownie zawiesić osad w buforze płuczącym B sześć razy i ponownie odwirować zawiesinę. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w mililitrach kompletnego podłoża DMEM i zasiać 2 mililitry zawiesiny komórkowej w kompletnym DMEM w dziewięciu dołkach po trzy sześciodołkowe płytki pokryte Matrigelem.

Umieść kultury komórkowe w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla na 24 godziny, a następnie ostrożnie usuń zanieczyszczenia z każdej studzienki i dodaj świeże podłoże DMEM. Po 48 godzinach zmieniaj pożywkę w każdym dołku co 48 godzin. W dniach od 8 do 10, gdy komórki osiągną 100% zbieżności, należy przenieść komórki w pożywce do hodowli pasożytów na nowe, pokryte żelatyną sześciodołkowe płytki i zwrócić komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na dodatkowe 6 do 7 dni z monitorowaniem.