JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:43 min • July 8th, 2025
Weź boczny zestaw z miękkim oświetleniem zawierającym akrylową tablicę wyposażoną w białe podkładki i białe diody LED zainstalowane na jednej krawędzi.
Umieścić z przodu płytkę wielodołkową o niskiej przyczepności zawierającą pożywkę do tworzenia ciał zarodków.
Dodaj ciała zarodkowe lub EB do płytki.
Światło LED wpada od strony płyty akrylowej i emituje równoległe wiązki, bocznie oświetlając EB i umożliwiając wizualizację gołym okiem.
Obróć płytkę, aby wywołać przepływ wirowy, zbiegając EB do środka.
Zastąp zużytą pożywkę świeżą pożywką tworzącą EB.
Zebrać EB za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze.
Trzymaj pipetę pionowo, aby umożliwić grawitacyjnemu osadzanie się EB.
Przenieś EB na inną płytkę o niskiej przyczepności zawierającą pożywkę do indukcji neuronalnej.
Przyłóż końcówkę do medium. EB toną z powodu napięcia powierzchniowego cieczy.
Specyficzne czynniki w pożywce inicjują różnicowanie neuronalne w EBs, tworząc warstwę neuronabłonkową.
Użyj przezroczystej płyty akrylowej o grubości od 0,3 do 0,5 centymetra w rozmiarze papieru A5 i wklej białe podkładki z przodu i z tyłu płyty akrylowej. Następnie zainstaluj rząd białych świateł LED na krawędzi płyty, tak aby światła mogły wchodzić od strony płyty akrylowej, a następnie wystrzeliwać równolegle.
Teraz przygotuj nową sześciodołkową płytkę o niskiej przyczepności i dodaj 2 mililitry pożywki tworzącej EB do każdej studzienki. Po usunięciu EB wraz z podłożem, za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze 1000 mikrolitrów, przenieś około 100 EB na studzienkę na 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności.
Aby codziennie zastępować pożywkę formacyjną EB tą samą objętością świeżej pożywki, należy wywołać przepływ wirowy, obracając szalkę po orbicie kołowej. EB lub organoidy zbiegają się do środka studni z powodu wtórnego przepływu generowanego przez rotację. Odessać starą pożywkę, pipetując powoli do krawędzi studzienki. Nie ssij zbyt mocno, w przeciwnym razie EB zostaną usunięte razem. Następnie dodaj nowy nośnik, aby ponownie zawiesić EB.
Do indukcji neuronalnej przygotuj nową 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności z 3 mililitrami pożywki do indukcji neuronów na studzienkę. Włącz boczne miękkie światło i wyłącz inne źródła światła w pomieszczeniach. Teraz przenieś EB na 6-dołkową płytkę z dodaną pożywką do indukcji neuronalnej, używając końcówki pipety z szeroką ustą, aby zassać zarówno EBs, jak i pożywkę hodowlaną. Następnie trzymaj pipetę pionowo. EB będą stopniowo opadać pod wpływem grawitacji i zbiegać się w kierunku ujścia końcówki pipety.
Gdy wylot końcówki pipety ponownie dotyka powierzchni cieczy, a także ze względu na napięcie powierzchniowe cieczy, EB szybko zanurzają się w medium. Próbki inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.