JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:06 min • July 8th, 2025
Weź zawiesinę komórek nerwowych, w tym niedojrzałe oligodendrocyty i pierwotne komórki neuronalne, od szczeniaka myszy.
Ponownie zawieś komórki w magnetycznym buforze do sortowania komórek, aby uniknąć zlepiania się komórek.
Dodaj zmodyfikowane mikrokulki magnetyczne niosące na swojej powierzchni przeciwciała anty-O4. Wymieszać roztwór, aby zapewnić równomierne wymieszanie.
Inkubować, aby umożliwić mikrogranulkom wiązanie się z siarczanowanym galaktolipidem, antygenem O4 na oligodendrocytach, podczas gdy inne komórki pozostają niezwiązane lub luźno związane.
Umyj mieszaninę dodatkowym buforem do sortowania komórek.
Odwirować i wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki.
Następnie przełóż komórki związane z koralikami do kolumny separacji magnetycznej wyposażonej w filtr, który usuwa większe grudki komórek.
Podczas biegu, pod wpływem pola magnetycznego, kompleksy związane z koralikami poruszają się w kierunku magnesu, przyczepiając się do boków.
Umyć, aby usunąć niezwiązane i luźno związane komórki.
Pobrać kolumnę z separatora i przemyć ją pożywką proliferacyjną w celu zebrania pierwotnych oligodendrocytów do przyszłych zastosowań.
Po zliczeniu ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w 90 mikrolitrach świeżego magnetycznego bufora do sortowania komórek na 1 x 107 komórek. Następnie dodaj 10 mikrolitrów kulek anty-O4 na 1 x 107 komórek i wymieszaj roztwór komórkowy z delikatnym trześnieniem. Po 15 minutach w temperaturze 4 stopni Celsjusza, delikatnie trzepiąc, co 5 minut, delikatnie dodać 2 mililitry magnetycznego buforu do sortowania komórek na 1 x 107 komórek do przemycia przez odwirowanie i wyrzucić supernatant przez staranne zasysanie próżniowe.
Zawiesić osad w 500 mikrolitrach świeżego magnetycznego bufora do sortowania komórek na każde 1 x10 7 komórek i umieścić kolumnę do sortowania kulek magnetycznych o odpowiedniej wielkości w odpowiednim separatorze magnetycznym. Umieść sitko o średnicy 40 mikronów na kolumnie i wstępnie przepłucz sitko 3 mililitrami magnetycznego buforu do sortowania komórek, pozwalając buforowi przepływać przez kolumnę bez dopuszczania do wyschnięcia kolumny. Dodaj komórki do sitka, a następnie przepłucz 1 mililitrem magnetycznym buforem do sortowania komórek.
Przemyć kolumnę trzykrotnie 3 mililitrami magnetycznego buforu do sortowania komórek na płukanie i jeden raz pożywką do proliferacji oligodendrocytów. Następnie przenieś kolumnę do 15-mililitrowej probówki i za pomocą tłoka natychmiast przepłucz 5 mililitrów świeżej pożywki proliferacyjnej oligodendrocytów przez kolumnę.