JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:45 min. • July 8th, 2025
Weź korzeń nerwowy i posiekaj go na małe kawałki.
Przenieść do rurki zawierającej enzymy trawienne i inkubować.
Enzym trawi macierz zewnątrzkomórkową.
Dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zatrzymać trawienie.
Kilkakrotnie odpipetować zawartość, a następnie odwirować i wyrzucić supernatant.
Ponownie zawiesić pellet.
Przepuścić zawiesinę przez sitko w celu usunięcia niestrawionej tkanki. Inkubuj zebrane komórki na płytce.
Fibroblasty i komórki Schwanna lub SC przyczepiają się do płytki i dzielą się.
Usuń niedołączone komórki. Umyj przyłączone komórki buforem fosforanowym.
Dodaj enzymy trawienne, aby rozluźnić wrażliwe na trawienie SC. Przerwij trawienie za pomocą pożywki.
Całkowicie odłącz SC, dodając nośnik.
Przenieś komórki do probówki i odwiruj. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce specyficznej dla SC.
Przenieść komórki na niepowlekaną płytkę i inkubować.
Wszelkie pozostałe fibroblasty będą przylegać, pozostawiając SC w zawiesinie.
Przenieść zawiesinę na płytkę pokrytą matrycą.
Inkubować w celu przyczepienia i podziału komórek Schwanna.
Pokrój nerwy nożyczkami na 3 do 5 milimetrowych kawałków. Dodaj 1 mililitr 0,25% trypsyny i przenieś kawałki nerwowe do 5-mililitrowych probówek wirówkowych. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 20 minut. Następnie, aby zatrzymać trawienie, dodaj 3 do 4 mililitrów DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej. Delikatnie odpipetować mieszaninę w górę i w dół, około 10 razy. Wirować 800 razy g przez 5 minut.
Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 do 3 mililitrach DMEM uzupełnionym 10% FBS. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez filtr o siatce 400, a następnie użyj zawiesiny do zaszczepienia 60-milimetrowej szalki Petriego. Inkubuj szalki Petriego przez 4 do 5 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla.
Gdy kultura osiągnie 90% konfluencji, umyj komórki raz za pomocą 1X PBS. Następnie, aby strawić komórki Schwanna, dodaj 1 mililitr 0,25% trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 60-milimetrowe naczynie. Po 8 do 10 sekundach w temperaturze pokojowej przerwij trawienie, dodając 3 mililitry DMEM uzupełnionego 10% FBS. Aby odłączyć komórki Schwanna, delikatnie przedmuchaj je pipetą.
Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są odłączone. Następnie zebrać pożywkę, która zawiera komórki Schwanna, i odwirować przy 800 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 mililitrach pożywki. Użyj zawiesiny do zaszczepienia niekodowanych 60-milimetrowych szalek Petriego i inkubuj szalki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut. Przenieś pożywkę, która będzie zawierać komórki Schwanna, do pożywki pokrytej poli-L-lizyną i inkubuj szalkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 dni.