Znakowanie markerów powierzchni komórek nerwowych za pomocą azydocukru podczas wspólnej hodowli z komórkami śródbłonka

Zacznij od dodania zawiesiny komórek śródbłonka mózgu myszy do przepuszczalnej wkładki membranowej płytki transwell.

Dodaj pożywkę wzrostową do dna i inkubuj.

Czynniki wzrostu i składniki odżywcze w pożywce pomagają komórkom rosnąć jako monowarstwa.

Usuń podłoże z dolnej studzienki i z wkładu.

Umyj wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię wkładu, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.

Dodaj adherentną pożywkę do wkładki i przenieś ją do studzienki pokrytej matrycą, zawierającej pierwotne korowe nerwowe komórki pnia i progenitorowe lub NSPC, a następnie inkubuj.

Dodaj azydocukier, nienaturalny analog prekursora kwasu sjalowego, zarówno do komórek śródbłonka, jak i NSPC i inkubuj.

Cytokiny i chemokiny wydzielane przez komórki śródbłonka sprzyjają wzrostowi NSPC w duże klony przypominające arkusze.

Azydocukry integrują się ze strukturami sialoglikanu na powierzchni komórki NSPC, znakując glikoproteinę. Umożliwia to identyfikację białek powierzchniowych komórek na ekspandowanych NSPC.

Aby przygotować komórki śródbłonka, ponownie zawieś osad komórek BEND3 z 0,10-centymetrowej szalki Petriego w 90% zbiegu z 9 mililitrami pożywki komórkowej BEND3. Dodaj 1 mililitr zawiesiny ogniw do jednej przepuszczalnej wkładki nośnej. Dodaj kolejne 2 mililitry pożywki BEND3 na studzienkę w dolnej komorze matrycy. Kontynuuj hodowlę komórek przez jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Jednego dnia po posianiu komórek we wkładkach należy delikatnie zassać pożywkę, najpierw z dolnej komory, a następnie z wkładów. Umyj powierzchnię wkładek trzykrotnie wstępnie podgrzanym DMEM. Umyj zewnętrzną powierzchnię wkładów, spłukując je wstępnie podgrzanym DMEM. Następnie dodaj 1 mililitr wstępnie podgrzanego AM do jednej wkładki. Przenieś wkładki do studzienek z pierwotnymi komórkami korowymi. Inkubuj kokulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 12 godzin.

Rozpuść Ac₄ManNAz w DMSO, aby osiągnąć stężenie 200 milimolowe. Pobrać płytkę do kohodowli śródbłonka nerwowego z inkubatora. Dodaj 1 mikrolitr bulionu Ac₄ManNAz do każdej dolnej komory i 0,5 mikrolitra na wkładkę do kokultury. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 5 dni. Podczas hodowli komórek dodaj 100 mikrolitrów RM na wkładkę i 200 mikrolitrów RM na dolną komorę, aby co drugi dzień ponownie karmić komórki śródbłonka i nerwowe.