JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:27 min. • July 8th, 2025
Weź bydlęcy ogon
.Usuń leżące tkanki i wyrostki kręgowe, a następnie przetnij poprzecznie, aby uzyskać segmenty.
Zidentyfikuj krążek międzykręgowy lub IVD, znajdujący się między płytkami wzrostu a płytkami końcowymi kręgów.
Wyciąć po obu stronach IVD i umieścić go w naczyniu zawierającym gazę nasączoną buforem w celu utrzymania żywotności tkanek.
Zeskrob przyczepioną tkankę kręgową i zmierz wysokość IVD.
Przemyć buforem w celu usunięcia resztek krwi i zdezynfekować IVD w buforze zawierającym antybiotyki.
Umieścić IVD w komorach bioreaktora zawierających media.
Pożywka w grupie fizjologicznej ma wysoką zawartość glukozy, podczas gdy w grupie patologicznej pożywka o niskiej glukozie indukuje niedobór składników odżywczych.
Umieść komory w bioreaktorze.
W przypadku fizjologicznego IVD należy codziennie stosować delikatne obciążenie. W przypadku patologicznego IVD należy codziennie stosować intensywne obciążenie w większej dawce.
Pomiędzy codziennymi testami obciążeniowymi pozwól na odzyskanie IVD w pożywce.
Po wszystkich procedurach załadunku zmierz wysokości IVD.
Zmniejszona wysokość w patologicznych IVD wskazuje na stan zwyrodnieniowy i prozapalny.
Zacznij od dokładnego spłukania całego ogona bydlęcego wodą z kranu, aby usunąć brud i sierść z powierzchni. Następnie zanurz ogon w 1% roztworze betadyny na 10 minut, aby zdezynfekować powierzchnię. Użyj skalpela numer 20, aby usunąć tkankę miękką z kręgosłupa ogonowego, aby ułatwić identyfikację krążków międzykręgowych lub IVD.
Usuń wyrostki kolczyste i poprzeczne kręgów za pomocą szczypiec do usuwania kości. Przeciąć poprzecznie szczypcami do kości przez środek każdego trzonu kręgu, aby uzyskać poszczególne segmenty ruchu, a następnie umieścić zebrane segmenty ruchu na szalce Petriego z gazą zwilżoną roztworem Ringera.
Zlokalizuj IVD i kręgi, delikatnie przesuwając segmenty ruchu. Następnie zidentyfikuj położenie płytki wzrostowej, dotykając i znajdując wypukłą stronę kostnej płytki końcowej. Schłodzić ostrze piły taśmowej roztworem Ringera i użyć go do wykonania dwóch równoległych nacięć w płytce wzrostowej IVD, po jednym z każdej strony.
Przenieść IVD na czystą płytkę Petriego z czystą gazą zwilżoną roztworem Ringera. Zeskrob trzon kręgu i płytkę wzrostową za pomocą ostrza skalpela, pozostawiając nienaruszoną płytkę końcową. Ustawić dwie powierzchnie płasko i równolegle do procedury załadunku, a następnie przenieść zeskrobane IVD na świeżą płytkę Petriego z gazą zwilżoną roztworem Ringera.
Zmierz wysokość i średnicę tarczy za pomocą suwmiarki. Następnie oczyść skrzepy krwi w kości kręgów roztworem Ringera za pomocą systemu płukania strumieniowego. Zdezynfekować IVD w PBS i 10% penicylinie-streptomycynie, wstrząsając przez 15 minut. Spłucz antybiotyki o wysokim stężeniu PBS i 1% penicyliny streptomycyny.
Przenieś krążki do komór IVD zawierających 5 mililitrów pożywki hodowlanej IVD i umieść je w systemie bioreaktora z inkubatorem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 85% i 5% dwutlenku węgla. Hoduj dyski przez cztery dni w systemie bioreaktora, utrzymując różne warunki obciążenia w zależności od grup eksperymentalnych.
W fizjologicznej grupie kontrolnej posiewa się pacjentów IVD z podłożem o wysokim poziomie glukozy, stosując protokół ładowania od 0,02 do 0,2 megapaskali i 0,2 herca przez dwie godziny dziennie. W grupie patologicznej należy hodować IVD z pożywką o niskim poziomie glukozy, stosując protokół ładowania od 0,32 do 0,5 megapaskali i 5 Hz przez dwie godziny dziennie.
Pomiędzy procedurami ładowania umieścić IVD w sześciodołkowych płytkach z 7 mililitrami pożywki do IVD w celu swobodnego powrotu do pęcznienia. Codziennie mierzyć wysokość tarczy za pomocą suwmiarki po okresie swobodnego pęcznienia i po obciążeniu dynamicznym przez czas trwania doświadczenia.