JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:19 min. • July 8th, 2025
Weź zawiesinę komórek i szczątków z enzymatycznie trawionych włókien nerwowych kulszowych myszy.
Przepuść przez sitko, usuwając zanieczyszczenia.
Odwirować filtrat i usunąć sklarowany nad osadem.
Ponownie zawiesić komórki w pożywce zawierającej surowicę i umieścić je na płytce hodowlanej pokrytej białkiem adhezyjnym.
Inkubować w celu adhezji komórek. Zastąp nośnik nośnikiem komórkowym Schwanna. Inkubować w celu wytworzenia monowarstwy komórek Schwanna.
Usuń podłoże i umyj je buforem. Inkubuj z trypsyną, aby odłączyć komórki.
Dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.
Zebrać komórki i odwirować. Odrzucić supernatant.
Ponownie zawiesić komórki w buforze i dodać mikrokulki magnetyczne pokryte przeciwciałami.
Inkubować w celu związania przeciwciał z glikoproteinami fibroblastów.
Odwirować i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić ogniwa w buforze i załadować je do kolumny separacji magnetycznej zawierającej kule ferromagnetyczne umieszczone w polu magnetycznym separatora magnetycznego.
Pole magnetyczne zatrzymuje fibroblasty związane z mikrokulkami, umożliwiając gromadzenie komórek Schwanna w przepływie.
Przenieś strawione nerwy do 50-mililitrowej probówki i odwiruj przy 188 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach DMEM zawierającym 10% FCS i 50 mikrogramów na mililitr gentamycyny.
Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 100 mikrometrów. Po odwirowaniu w temperaturze 188 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, ponownie zawiesić osad z 4 mililitrami DMEM zawierającego FCS i gentamycynę. Dodaj 2 mililitry zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch 60-milimetrowych naczyń do hodowli tkankowych pokrytych poli-L-lizyną i lamininą. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, pozostawiając płytki nietknięte przez 2 dni w inkubatorze.
Odwirować zawiesinę komórek Schwanna o masie 188 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad komórkowy w 90 mikrolitrach magnetycznego buforu do separacji komórek na 1 x 107 komórek. Następnie dodaj 10 mikrolitrów mikrogranulek Thy-1 na 1 x 107 komórek. Zawiesinę roztworu inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 8 stopni Celsjusza.
Następnie dodaj 2 mililitry buforu do separacji komórek magnetycznych do zawiesiny komórek. Po odwirowaniu w 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach magnetycznego buforu do separacji komórek. Umieść magnetyczną kolumnę do separacji komórek w separatorze komórek i zwilż kolumnę 1 mililitrem magnetycznego bufora do separacji komórek. Następnie nałóż na niego komórki, aby zebrać przepływ.