Technika izolowania jąder od komórek nieneuronalnych w zakręcie zębatym hipokampa

Weź zakręt zębaty z mózgu myszy w zimnym buforze homogenizacyjnym

.

Mechanicznie dysocjuj w celu uwolnienia neuronów, komórek glejowych i macierzystych.

Łagodny detergent zawarty w buforze przenika do komórek, uwalniając jądra i inne organelle.

Przefiltruj homogenat, aby usunąć resztki tkanek. Następnie odwirować, usunąć organelle i ponownie zawieś w buforze homogenizacyjnym w celu lizy nienaruszonych komórek.

Ponownie odwirować, usunąć supernatant zawierający uwolnione organelle i ponownie zawiesić jądra w buforze do płukania.

Przefiltrować, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, odwirować i usunąć supernatant.

Wprowadź fluorescencyjne barwienie DNA, aby oznaczyć wszystkie jądra i przeciwciało sprzężone z fluoroforem, które wiąże się z neuronalnym antygenem jądrowym lub NeuN, znakując jądra neuronów.

Korzystając z sortowania jąder aktywowanych fluorescencją, zidentyfikuj agregaty o wyższej intensywności fluorescencji barwienia DNA i wyższych właściwościach rozpraszania, oddzielając pojedyncze jądra.

Przeanalizuj pojedyncze jądra, oddzielając jądra neuronalne NeuN-dodatnie i izolując jądra NeuN-ujemne należące do komórek glejowych i macierzystych.

Homogenizować tkankę za pomocą 10 pociągnięć luźnym tłuczkiem A, a następnie 15 pociągnięć ciasnym tłuczkiem B. Przenieść homogenat do wstępnie schłodzonej 15-mililitrowej probówki. Przepłucz homogenizator Dounce 1 mililitrem zimnego HB i połącz go z tą samą probówką.

Dodaj 3 mililitry HB do 15-mililitrowej probówki i inkubuj przez 5 minut na lodzie. Wymieszaj zawiesinę jąder dwukrotnie, delikatnie odwracając probówkę. Używając 0,5 mililitra HB, wstępnie zwilż 70-mikrometrową nasadkę sitka umieszczoną na 50-mililitrowej probówce. Następnie odcedź zawiesinę jąder przed umyciem sitka komórkowego 0,5 mililitra HB.

Następnie wyjmij sitko komórkowe i odwiruj probówkę w wirówce z wiadrem obrotowym o masie 500 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant. Delikatnie zawiesić granulkę w 4 mililitrach HB za pomocą pipety P1000.

Po pięciu minutach inkubacji na lodzie odwirować zawiesinę o masie 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 3 mililitrach środka myjącego. Użyj 0.5 mililitra środka myjącego, aby wstępnie zwilżyć 35-mikrometrową nasadkę sitka na 50-mililitrowej probówce. Następnie odcedzić zawiesinę jąder, pipetując jednorazowo 0,5 mililitra zawiesiny za pomocą pipety P1000.

Po umyciu nakrętki sitka 0,5 mililitra środka myjącego, umieść rurkę na lodzie. Przenieś filtrat do nowej 15-mililitrowej probówki i odwiruj go przez 5 minut i 4 stopnie Celsjusza w temperaturze 500 g. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 3 mililitrach pożywki myjącej.

Powtórz wirowanie i ponownie zawieś osad w 1 mililitrze pożywki myjącej z mysim przeciwciałem sprzężonym z anty-Neu i AlexaFlour488 oraz 1 mikrogramem na mililitr DAPI. Inkubować reakcję przez 45 minut na lodzie w ciemności.

W przypadku sortowania jąder aktywowanych fluorescencją lub FANS, przenieś zawiesinę jąder wybarwionych immunologicznie do 5-mililitrowej probówki i umieść ją na lodzie do czasu rozpoczęcia procedury cytometrii przepływowej.

Wirować próbki przez trzy sekundy z łagodną intensywnością przed umieszczeniem probówek w instrumencie FACS.

Aby uzyskać dane z zawiesiny jąder barwnika, ustaw bramki na wysokości DAPI i obszarze DAPI, aby wykluczyć resztki komórek i zagregowane jądra. Następnie ustaw bramki w obszarze logarytmu bocznego lub SSC oraz obszarze logarytmu i rozproszenia do przodu lub FSC, aby oddzielić pojedyncze jądra od pozostałego agregatu lub szczątków komórkowych zabarwionych DAPI.

Następnie wyizoluj populację NeuNAF488-ujemną, ustawiając bramki dla obszaru anty-NeuNAF488 i FSC.

Po analizie posortuj populację anty-NeuNAF488-ujemną w 1,5-mililitrowej probówce zbiorczej wypełnionej 50 mikrolitrami pożywki myjącej, stosując strategię bramkowania.