JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:59 min. • July 8th, 2025
Weźmy genetycznie modyfikowane bakterie na pożywce dla nicieni.
Bakterie są nosicielami plazmidu z genem czynnika regulującego chromatynę nicieni.
Pożywka zawiera induktor, który wyzwala ekspresję transgenicznej polimerazy RNA z genomu bakteryjnego, który transkrybuje gen czynnika regulującego chromatynę do dsRNA.
Dodaj transgeniczne larwy nicieni przenoszące gen czynnika transkrypcyjnego indukującego los neuronów pod promotorem szoku cieplnego.
Po spożyciu przez bakterie spożyte dsRNA generuje siRNA, które obniża ekspresję czynnika regulującego chromatynę, ułatwiając przeprogramowanie losu komórki.
Poprzez komórki rozrodcze rodziców siRNA jest przekazywane potomstwu.
Regulacja w dół ekspresji czynnika regulującego chromatynę w potomnych komórkach rozrodczych, na co wskazuje fenotyp wystającego sromu, umożliwia ich przeprogramowanie.
Zastosuj szok cieplny do potomstwa, aktywując promotor szoku cieplnego i wyrażając czynnik transkrypcyjny indukujący los neuronów, który wyzwala różnicowanie neuronów, przekształcając komórki rozrodcze w neurony.
Neurony wyrażają transgeniczne fluorescencyjne białko reporterowe, ułatwiając mikroskopową wizualizację.
Ręcznie przenieś 50 robaków L4 na replikę na płytkę RNAi NGM. Użyj drutu platynowego. Robaki L4 można rozpoznać po białej plamie mniej więcej w połowie ich brzusznych boków. Teraz wysiaduj robaki w temperaturze 15 stopni Celsjusza w ciemności przez około siedem dni. IPTG jest światłoczuły.
Kiedy potomstwo F1 osiągnie stadium L3 i L4, oddziel je od większych, grubszych zwierząt rodzicielskich. W tym momencie należy przebadać F1 pod kątem fenotypu wystającego sromu, co wskazuje, że RNAi przeciwko lin-53 zakończyło się sukcesem. Aktywność RNAi może również powodować śmiertelność, która wzrasta powyżej 15 stopni Celsjusza. Aby aktywować G1 i skłonić komórkę rozrodczą do konwersji neuronów w potomstwie F1, należy poddawać robaki szokowi cieplnemu przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Użyj wentylowanego inkubatora, ponieważ pozwala to na bardziej efektywny szok cieplny.
Po szoku cieplnym inkubuj płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc w ciemności. Ważne jest, aby unikać wywoływania nadekspresji Q1 przez szok cieplny, zanim zwierzęta osiągną połowę stadium L3. Może to prowadzić do ekspresji białka Q1 w tkankach niedocelowych. Następnego dnia ustaw fluorescencyjne źródło światła i filtr GFP, aby zbadać zwierzęta pod kątem fluorescencji pochodzącej z transgenu w obszarze środkowej części ciała.