JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:26 min. • July 8th, 2025
Zacznij od mózgu nowonarodzonego myszy i przenieś go do probówki zawierającej roztwór enzymu proteolitycznego.
Enzymy degradują macierz zewnątrzkomórkową tkanki i inicjują dysocjację komórki.
Kilkakrotnie przemyj strawioną tkankę pożywką wzrostową, aby usunąć enzymy.
Użyj pipety o większej średnicy, aby wielokrotnie przesuwać tkankę przez pipetę, aby zdysocjować ją na mniejsze fragmenty.
Następnie, używając pipety o mniejszej średnicy, kontynuuj dysocjację fragmentów, tworząc zawiesinę komórek.
Przefiltruj tę zawiesinę, aby usunąć grudki komórek i uzyskać zawiesinę jednokomórkową zawierającą pierwotne neurony i mieszaną populację komórek glejowych, w tym mikrogleju i astrocytów.
Wysiewać komórki w kolbie hodowlanej zawierającej pożywkę wzrostową i inkubować, aby zwiększyć ich przyleganie.
Z biegiem czasu brak czynników wzrostu neuronów w pożywce powoduje śmierć neuronów.
Zastąp zużyte nośniki nowymi nośnikami. Komórki glejowe wykorzystują składniki odżywcze i namnażają się, tworząc mieszaną kulturę glejową astrocytów i mikrogleju.
Przenieś mózg do 50-mililitrowej probówki zawierającej 2 mililitry 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj mózg świeżą pożywką wzrostową, dodając i usuwając pożywkę. Po zakończeniu płukania dodaj 2 mililitry pożywki wzrostowej na mózg i homogenizuj, rozcierając mózg.
Gdy tkanka mózgowa nie zmniejszy się, przejdź na pipetę o mniejszym otworze. Pod koniec miareczkowania, gdy zawiesina jest przezroczysta bez widocznych kawałków, przepuść zawiesinę przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów, aby utworzyć hodowlę jednokomórkową.
Następnie odpipetować od 8 do 9 milimetrów pożywki wzrostowej do kolb T75, po dwie kolby na mózg i dodać 1 mililitr homogenatu mózgu do każdej kolby. Hoduj komórki do izolacji 16 dnia.